Au laboratoire, un peptide lyophilisé doit être dissous avant de pouvoir être utilisé. Deux liquides reviennent le plus souvent : l'eau bactériostatique et l'eau stérile. À première vue, rien ne les distingue, toutes deux sont limpides et stériles. La différence tient à un seul ingrédient ajouté. C'est pourtant lui qui détermine combien de temps un flacon ouvert peut être utilisé et à quelles expériences le liquide convient.
Qu'est-ce que l'eau bactériostatique
La pharmacopée américaine (USP) définit l'eau bactériostatique (Bacteriostatic Water for Injection) comme une eau stérile de qualité pharmacopée contenant un ou plusieurs agents antimicrobiens appropriés. Le conservateur est généralement l'alcool benzylique. La notice du fabricant Hospira, par exemple, décrit une eau stérile et apyrogène contenant 0,9 % d'alcool benzylique (9 mg/ml), ou 1,1 % pour l'une de ses présentations. Selon la même notice, le pH est d'environ 5,7 (plage de 4,5 à 7,0).
Selon la notice officielle, l'eau bactériostatique est destinée uniquement à diluer ou à dissoudre d'autres préparations. C'est donc un diluant (en anglais diluent), et non un produit à part entière. La pharmacopée précise en outre qu'il faut tenir compte de la compatibilité du conservateur avec la substance dissoute. Nous y reviendrons.
Le mot « bactériostatique » signifie qu'une substance freine la croissance et la multiplication des bactéries. Cela ne veut pas dire qu'elle les tue de façon fiable. Les substances qui tuent les bactéries sont dites bactéricides. À propos des flacons multidoses, les Centres américains pour le contrôle et la prévention des maladies (CDC) indiquent que le conservateur aide à limiter la croissance bactérienne, mais qu'il n'agit pas sur les virus et ne protège pas totalement contre la contamination. L'eau bactériostatique ne remplace donc pas le travail aseptique.
Qu'est-ce que l'eau stérile
La Pharmacopée européenne décrit, dans la monographie Eau pour préparations injectables (0169), deux formes de cette eau. L'eau « en vrac » sert de véhicule lors de la fabrication des médicaments. L'eau stérilisée (eau pour préparations injectables stérilisée) est destinée à dissoudre ou à diluer d'autres préparations. C'est aussi ce que résume la ligne directrice de l'Agence européenne des médicaments (EMA) sur la qualité de l'eau à usage pharmaceutique. La pharmacopée américaine connaît un produit équivalent sous le nom de Sterile Water for Injection.
L'essentiel est ce que l'eau stérile ne contient pas. La notice d'Hospira indique qu'elle ne contient ni agent bactériostatique, ni agent antimicrobien, ni tampon ajouté, et qu'elle n'est fournie qu'en récipients unidoses. La consigne du fabricant est claire : ne pas réutiliser les récipients unidoses et jeter toute portion non utilisée.
La raison est simple. Dès qu'un flacon est ouvert ou percé, des micro-organismes peuvent y pénétrer. Sans conservateur, rien ne freine leur croissance. L'eau stérile est donc « plus pure » en ce sens qu'elle ne contient que de l'eau. Une fois ouverte, elle est toutefois traitée comme un produit à usage unique.
Pourquoi un conservateur : les récipients multidoses
L'eau bactériostatique est fournie en récipients multidoses dans lesquels, selon la notice, on peut effectuer des prélèvements répétés. C'est précisément pour cela qu'elle contient un conservateur. La pharmacopée américaine prévoit pour elle des récipients en verre de 30 ml au maximum.
Un conservateur ne signifie pas pour autant une utilisation illimitée après ouverture. Dans les établissements de santé et les pharmacies aux États-Unis, les récipients multidoses relèvent de la recommandation du chapitre USP <797>, que résument aussi les CDC : après la première ouverture (par exemple le percement du bouchon), le flacon est daté et éliminé au plus tard dans les 28 jours, sauf si le fabricant indique un autre délai, plus court ou plus long, pour le flacon ouvert. Selon les CDC, les flacons unidoses ne contiennent généralement pas de conservateur.
Nous le mentionnons comme exemple de pratique générale pour les récipients multidoses, et non comme une consigne. Au laboratoire, ce sont toujours les indications du fabricant sur l'étiquette du produit concerné et les procédures internes (SOP) de votre laboratoire qui font foi.
Quand l'alcool benzylique peut poser problème au laboratoire
L'alcool benzylique n'est pas un additif inerte. Dans certaines situations, il peut influencer la substance dissoute ou le résultat d'une expérience.
Protéines et agrégation. Les conservateurs des formulations protéiques multidoses sont connus pour pouvoir favoriser l'agrégation des protéines. Une étude de 2014 a comparé quatre conservateurs courants sur l'interféron alfa-2a. Tous ont provoqué une agrégation, et l'alcool benzylique s'est classé troisième, après le m-crésol et le phénol. Un autre travail a porté sur une protéine lyophilisée (l'antagoniste du récepteur de l'interleukine-1), que les chercheurs ont reconstituée soit dans de l'eau, soit dans une solution à 0,9 % d'alcool benzylique. Davantage d'agrégats se sont formés avec l'alcool benzylique. Leur quantité dépendait de la façon dont la protéine avait conservé sa structure pendant la lyophilisation.
Ces études portent sur des protéines, et non sur des peptides courts, et leurs résultats ne sont pas directement transposables. Le comportement de chaque substance dépend de sa séquence. On ne peut donc pas supposer que l'alcool benzylique soit compatible avec toutes les substances.
Cultures cellulaires et essais sensibles. L'alcool benzylique agit sur les membranes cellulaires. Dans des expériences sur des cellules endothéliales en culture, il a augmenté la fluidité membranaire de façon dose-dépendante et, à 50 mmol/l, a nettement accru la perméabilité de la couche cellulaire. À titre de comparaison, 0,9 % d'alcool benzylique correspond à environ 83 mmol/l. Après dilution dans le milieu de culture, la concentration est bien sûr plus faible. Pour des essais cellulaires sensibles, il est néanmoins utile d'envisager un solvant sans conservateur, ou au moins d'inclure un témoin contenant uniquement le solvant.
Solubilité. Tous les peptides ne se dissolvent pas bien dans l'eau, avec ou sans conservateur. Des fournisseurs de peptides comme GenScript et Bachem décrivent une démarche générale dans leurs guides :
- tester d'abord la solubilité sur une petite quantité de la substance,
- pour les peptides courts, essayer d'abord l'eau stérile,
- dissoudre les peptides basiques (charge globale positive) dans une petite quantité d'acide acétique dilué, puis diluer,
- dissoudre les peptides acides (charge globale négative) dans une petite quantité d'ammoniaque diluée ; GenScript le déconseille pour les peptides contenant de la cystéine,
- dissoudre les peptides hydrophobes et neutres dans une petite quantité d'un solvant organique, typiquement le DMSO, et seulement ensuite diluer avec de l'eau ou un tampon.
Bachem souligne par ailleurs que des concentrations élevées de solvants organiques sont incompatibles avec les systèmes biologiques tels que les cellules. Selon Bachem, il n'existe pas de protocole universel pour tous les peptides. Le choix du solvant dépend donc du protocole expérimental et des données de solubilité, lorsque le fournisseur les indique dans une fiche technique ou un certificat d'analyse.
Dissoudre un peptide lyophilisé : principes généraux
Les points suivants décrivent la pratique générale de laboratoire. Les quantités et les concentrations sont toujours fixées par le protocole de l'expérience concernée.
- Laissez le flacon revenir à température ambiante. Les peptides sont souvent hygroscopiques. Bachem recommande donc de laisser le récipient fermé atteindre la température ambiante, idéalement dans un dessiccateur, avant de l'ouvrir. L'humidité absorbée réduit la teneur en peptide et peut diminuer sa stabilité.
- Travaillez de façon aseptique. Essuyez les bouchons du flacon de peptide et du flacon de solvant avec un tampon imbibé d'alcool et laissez-les sécher. Utilisez du matériel stérile à usage unique.
- Ajoutez le solvant lentement le long de la paroi intérieure du flacon, et non en jet direct sur le lyophilisat.
- Faites tourner doucement, sans secouer. Les contraintes mécaniques, comme une agitation vigoureuse, figurent parmi les facteurs décrits pouvant provoquer l'agrégation des protéines. Si une partie de la substance reste non dissoute, Bachem mentionne quelques minutes dans un bain à ultrasons.
- Vérifiez l'aspect. La solution doit être limpide, sans trouble ni particules visibles. Un trouble peut signaler une dissolution incomplète ou une agrégation. Dans ce cas, mieux vaut revenir aux données de solubilité du fournisseur que de poursuivre.
- Étiquetez le flacon avec le nom de la substance, le solvant utilisé et la date de préparation.
Conservation de l'eau bactériostatique ouverte et des solutions préparées
Eau bactériostatique. La notice d'Hospira indique une conservation entre 20 et 25 °C. L'eau bactériostatique de notre gamme se conserve à température ambiante, à l'abri de la lumière. Les indications figurant sur l'étiquette du produit concerné s'appliquent toujours. Après la première ouverture, il est recommandé d'inscrire la date sur le flacon.
La notice précise expressément qu'il faut travailler de façon aseptique lors de toute entrée et de tout prélèvement, unique ou répété. En pratique, cela signifie essuyer le bouchon avec un tampon imbibé d'alcool avant chaque prélèvement et le laisser sécher, utiliser du matériel stérile neuf et ne jamais rien remettre dans le flacon. Par règle générale, un contenu trouble ou contenant des particules visibles n'est pas utilisé.
Solutions peptidiques préparées. Bachem recommande de ne pas conserver les peptides en solution à long terme, même en solution stérile. Lorsque cela ne peut être évité, il conseille de répartir la solution en portions plus petites (aliquots). Selon Bachem, les peptides contenant de l'asparagine, de la glutamine, de la méthionine, de la cystéine ou du tryptophane ont une durée de conservation plus courte. Les conditions de conservation précises sont toujours fixées par le fournisseur de la substance. Pour les produits Arion Bios, ce sont les consignes indiquées avec le produit qui s'appliquent : conserver entre 2 et 8 °C, à l'abri de la lumière, ne pas congeler et garder dans l'emballage d'origine fermé.
Comparatif : eau bactériostatique ou eau stérile
| Caractéristique | Eau bactériostatique | Eau stérile |
|---|---|---|
| Composition | Eau stérile de qualité pharmacopée avec un conservateur, typiquement 0,9 % d'alcool benzylique | Eau stérile de qualité pharmacopée sans substance ajoutée |
| Conservateur | Oui – freine la croissance bactérienne, ne tue pas les bactéries de façon fiable, sans effet sur les virus | Non |
| Conditionnement | Multidose, permet des prélèvements répétés | Unidose |
| Après ouverture | Prélèvements répétés en conditions aseptiques ; le délai est fixé par le fabricant (pratique générale pour les récipients multidoses : 28 jours, sauf indication contraire du fabricant) | Toute portion non utilisée est jetée |
| Usage typique au laboratoire | Dissolution de substances compatibles avec l'alcool benzylique, lorsque le solvant est prélevé à plusieurs reprises dans un même flacon | Expériences où un conservateur serait gênant (cultures cellulaires et essais sensibles, substances sujettes à l'agrégation) et préparation ponctuelle d'une solution |
| Limites | L'alcool benzylique peut favoriser l'agrégation des protéines, agit sur les membranes cellulaires et peut influencer certains essais | Aucune protection contre la croissance microbienne après ouverture |
L'eau bactériostatique chez Arion Peptides
Nous proposons de l'eau bactériostatique comme accessoire de laboratoire pour les peptides de recherche lyophilisés : eau bactériostatique. Comme tous nos produits, elle est destinée exclusivement à un usage de laboratoire et de recherche. Les certificats d'analyse des lots de peptides Arion Bios sont disponibles sur la page certificats d'analyse.
Questions fréquentes
L'eau bactériostatique est-elle la même chose que l'eau stérile ?
Non. La base est la même : une eau stérile de qualité pharmacopée. L'eau bactériostatique contient en plus un conservateur, généralement 0,9 % d'alcool benzylique, et elle est fournie en récipient multidose. L'eau stérile ne contient aucun additif et, une fois ouverte, est destinée à un usage unique.
L'eau bactériostatique tue-t-elle les bactéries ?
Pas de façon fiable. Le conservateur freine la croissance et la multiplication des bactéries, mais ce n'est pas un désinfectant. Selon les CDC, il n'agit pas sur les virus et ne protège pas totalement contre la contamination. Le travail aseptique reste donc nécessaire.
Combien de temps peut-on utiliser un flacon d'eau bactériostatique ouvert ?
Ce sont les indications du fabricant sur l'étiquette qui priment. Dans le domaine de la santé, un délai de 28 jours après la première ouverture s'applique généralement aux récipients multidoses selon l'USP <797>, sauf indication contraire du fabricant. L'eau stérile sans conservateur est unidose, et le reste est jeté après ouverture.
Quand privilégier l'eau stérile ou un autre solvant ?
Lorsque l'alcool benzylique pourrait influencer le résultat, par exemple avec des cultures cellulaires et des essais sensibles ou avec des substances sujettes à l'agrégation. La solubilité de la substance elle-même peut aussi imposer un autre solvant, comme l'acide acétique dilué pour les peptides basiques ou le DMSO pour les peptides hydrophobes. Le protocole expérimental et les données du fournisseur sont déterminants.
Sources
- Hospira, Inc. (Pfizer), « Bacteriostatic Water for Injection, USP », notice (prescribing information) : labeling.pfizer.com
- Hospira, Inc. (Pfizer), « Sterile Water for Injection, USP », notice (prescribing information) : labeling.pfizer.com
- United States Pharmacopeia, « Bacteriostatic Water for Injection », monographie, USP 38–NF 33, 2015 : drugfuture.com
- Agence européenne des médicaments (EMA), « Guideline on the quality of water for pharmaceutical use », EMA/CHMP/CVMP/QWP/496873/2018, 2020 (avec renvoi à la monographie Ph. Eur. 0169 Eau pour préparations injectables) : ema.europa.eu
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC), « Preventing Unsafe Injection Practices », synthèse des recommandations de l'USP <797> pour les flacons multidoses et unidoses : cdc.gov
- Bis RL, Mallela KMG, « Antimicrobial preservatives induce aggregation of interferon alpha-2a: the order in which preservatives induce protein aggregation is independent of the protein », International Journal of Pharmaceutics, 2014;472:356–361. DOI : 10.1016/j.ijpharm.2014.06.044
- Roy S, Jung R, Kerwin BA, Randolph TW, Carpenter JF, « Effects of benzyl alcohol on aggregation of recombinant human interleukin-1-receptor antagonist in reconstituted lyophilized formulations », Journal of Pharmaceutical Sciences, 2005;94(2):382–396. DOI : 10.1002/jps.20258
- Mahler HC, Friess W, Grauschopf U, Kiese S, « Protein aggregation: pathways, induction factors and analysis », Journal of Pharmaceutical Sciences, 2009;98(9):2909–2934. DOI : 10.1002/jps.21566
- Alvarado A, Butterfield DA, Hennig B, « Disruption of endothelial barrier function: relationship to fluidity of membrane extracellular lamella », International Journal of Biochemistry, 1994;26(4):575–581. DOI : 10.1016/0020-711x(94)90016-7
- GenScript, « Peptide Solubility Guidelines », guide technique : genscript.com
- Bachem, « Handling and Storage Guidelines for Peptides », Knowledge Center : bachem.com