Certificat d’analyse d’un peptide : comment lire un CoA

Une poudre lyophilisée blanche a toujours le même aspect. Qu’il s’agisse d’un peptide pur, d’un mélange contenant des sous-produits de synthèse ou d’une tout autre molécule, l’œil ne fait pas la différence. Seuls des essais de laboratoire montrent ce que contient réellement le flacon. Dans ce guide, nous passons en revue un certificat d’analyse étape par étape.

Qu’est-ce qu’un certificat d’analyse et pourquoi est-il important

Un certificat d’analyse (en anglais certificate of analysis, abrégé CoA) est un rapport présentant les résultats des essais réalisés sur un lot précis d’une substance. Il indique les méthodes utilisées, les valeurs mesurées et si les résultats respectent des limites fixées à l’avance.

Pour la recherche, cela a une portée pratique. Les peptides synthétiques sont produits par lots, et la synthèse génère des sous-produits : peptides avec un acide aminé manquant ou en trop, formes oxydées, restes de groupements protecteurs ou contre-ions indésirables. Une revue publiée dans le Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis souligne que ces impuretés peuvent fausser les résultats d’études de laboratoire précoces et conduire à des conclusions erronées. Pour qu’une expérience soit reproductible, il faut savoir avec quelle substance, et de quelle qualité, on a travaillé.

Ce que doit contenir un certificat d’analyse sérieux

Le format varie selon le fabricant et le laboratoire. Un certificat fiable devrait toutefois contenir au minimum les informations suivantes :

• le nom de la substance, idéalement avec sa séquence ou sa formule brute,
• le numéro de lot (batch, lot) ou la date de fabrication, qui permet de rattacher le certificat à un conditionnement précis,
• la date de l’analyse,
• le nom du laboratoire qui a réalisé les essais,
• les méthodes utilisées, par exemple la RP-HPLC avec détection UV et la spectrométrie de masse,
• les résultats accompagnés des critères d’acceptation, c’est-à-dire ce qui a été mesuré et la limite que l’échantillon devait respecter (par exemple « pureté ≥ 98 % »),
• une signature ou un autre moyen de vérification, comme le nom de la personne responsable ou un code de vérification.

Les données brutes jointes, c’est-à-dire le chromatogramme et le spectre de masse, sont un réel avantage. Un chiffre sans graphique est beaucoup plus difficile à vérifier.

Le projet de ligne directrice de l’Agence européenne des médicaments (EMA) sur les peptides synthétiques prévoit une liste encore plus large pour les substances médicamenteuses : outre l’identité et la pureté, la teneur en peptide, les contre-ions, l’eau, les endotoxines et la pureté microbiologique. Le certificat d’une substance de recherche n’a pas à tout couvrir, mais cette liste montre quelles questions poser.

Pureté HPLC : ce que signifie le « pourcentage d’aire »

La donnée la plus fréquente sur un certificat est la pureté déterminée par chromatographie liquide haute performance (HPLC), généralement en phase inverse (RP-HPLC). L’échantillon traverse une colonne qui sépare ses composants, et un détecteur en sortie mesure l’absorption de la lumière ultraviolette (UV). On obtient un chromatogramme : une courbe avec des pics, chaque pic correspondant à une ou plusieurs substances.

Pour les peptides, la détection UV est le plus souvent réglée sur une longueur d’onde d’environ 214 nm. À cette longueur d’onde, la liaison peptidique, celle qui relie les acides aminés et que possède tout peptide, absorbe fortement. Le détecteur repère ainsi le peptide principal et la plupart des impuretés peptidiques.

La pureté est calculée en pourcentage d’aire (area %) : l’aire du pic du peptide recherché divisée par la somme des aires de tous les pics enregistrés. Une pureté de 98,5 % signifie donc que le pic principal représente 98,5 % de l’aire totale des pics à cette longueur d’onde.

C’est un chiffre utile, mais il a ses limites. La pureté HPLC :

• ne prouve pas l’identité. Elle montre seulement qu’un composant domine l’échantillon, pas qu’il s’agit de la bonne molécule.
• peut passer à côté d’impuretés ayant le même temps de rétention que le pic principal. Une note d’application de Thermo Fisher Scientific précise que de telles impuretés coéluées ne peuvent pas être exclues sur la seule base du tracé UV.
• n’est pas un bilan massique exact. Les peptides n’ont pas tous la même réponse UV, si bien que l’aire d’un pic ne correspond pas toujours exactement à une masse.
• ne dit rien de la quantité. La pureté exprime la part du peptide recherché parmi les composants peptidiques. L’eau et les sels n’y sont pas comptés.

Spectrométrie de masse : est-ce vraiment la bonne molécule ?

L’identité, c’est-à-dire le fait que le flacon contient bien le peptide déclaré, est confirmée par la spectrométrie de masse (MS). Pour les peptides, on utilise le plus souvent l’ionisation par électronébulisation (ESI-MS), fréquemment couplée directement à la chromatographie (LC-MS). L’appareil ne pèse pas directement les molécules. Il mesure le rapport masse sur charge, noté m/z.

Lors de l’ionisation, un peptide capte un ou plusieurs protons. Une même molécule peut donc apparaître dans le spectre sous forme de plusieurs pics : avec une charge ([M+H]⁺), avec deux ([M+2H]²⁺), et ainsi de suite. On peut recalculer la masse de la molécule à partir de chaque pic : M = z × (m/z − 1,007), où z est le nombre de charges et 1,007 la masse d’un proton.

Exemple : selon PubChem, le BPC-157 a pour formule C₆₂H₉₈N₁₆O₂₂ et une masse molaire de 1419,5 g/mol. Le spectre devrait donc montrer approximativement les valeurs suivantes (calculées à partir de la masse moyenne et arrondies) :

Pour le MOTS-c, de masse molaire 2174,6 g/mol, l’ion doublement chargé se situerait vers m/z 1088,3 et l’ion triplement chargé vers 725,9.

Le certificat devrait indiquer la masse théorique et la masse mesurée, et les deux devraient concorder. Un article sur le contrôle des peptides synthétiques paru dans Pharmaceutical Technology cite comme exemple l’exigence d’une masse monoisotopique mesurée à ±1,0 unité de masse au plus de la valeur théorique. Attention aux deux types de masse : la masse moyenne (1419,5 pour le BPC-157) tient compte de la répartition naturelle des isotopes, la masse monoisotopique (environ 1418,7) uniquement des isotopes les plus légers. Les appareils de plus faible résolution indiquent généralement la masse moyenne, les appareils à haute résolution la masse monoisotopique.

La masse seule ne révèle cependant pas tout. Un peptide composé des mêmes acides aminés dans un autre ordre a la même masse. C’est pourquoi on recourt à la fragmentation (MS/MS) pour confirmer la séquence, et le projet de ligne directrice de l’EMA recommande au moins deux méthodes indépendantes (orthogonales) pour identifier un peptide, par exemple la LC-MS et l’analyse des acides aminés.

La pureté n’est pas la teneur : combien de peptide contient le flacon

C’est ici que naît le malentendu le plus fréquent. La pureté indique quelle part du matériel peptidique correspond au peptide recherché. La teneur en peptide (en anglais net peptide content) indique quelle part du poids total de la poudre est du matériel peptidique. Le reste se compose de contre-ions et d’eau résiduelle.

Les contre-ions s’introduisent pendant la fabrication. L’acide trifluoroacétique (TFA) sert à cliver le peptide terminé lors de la synthèse en phase solide, ainsi que d’additif lors de la purification par HPLC. Après lyophilisation, le peptide se présente sous forme de sel de trifluoroacétate. Une étude de 2025 a mesuré, pour les peptides étudiés, des teneurs en TFA allant jusqu’à 35 % du poids total du sel. Selon l’EMA, l’acétate est le contre-ion habituellement utilisé pour les peptides synthétiques, mais l’acétate n’est pas non plus du peptide. En outre, la poudre lyophilisée fixe de l’eau.

Le poids de la poudre se compose donc de peptide, de contre-ions et d’eau. Le fabricant de peptides Bachem donne l’exemple d’une teneur en peptide de 85 % : sur 1 mg de poudre, 0,85 mg correspondent à du matériel peptidique. Cette part inclut en outre les impuretés peptidiques. Bachem souligne aussi que deux échantillons de même pureté, 95 %, peuvent contenir des quantités différentes du peptide cible si leur teneur diffère (par exemple 80 % contre 95 %).

C’est pourquoi un flacon d’une pureté de 99 % peut contenir moins de 10 mg de peptide alors que l’étiquette indique 10 mg. Tout dépend de savoir si la valeur se rapporte au poids de la poudre ou à la teneur nette en peptide. Un bon certificat le précise explicitement ou comporte une donnée distincte sur la teneur ou la quantité de peptide.

La teneur en peptide se détermine par exemple par :

• l’analyse des acides aminés, qui décompose le peptide en acides aminés individuels que l’on mesure ensuite,
• l’analyse élémentaire de l’azote, car ni les contre-ions ni l’eau ne contiennent d’azote,
• l’HPLC quantitative par rapport à un étalon de référence de teneur connue.

La teneur en contre-ions se mesure par exemple par chromatographie ionique. L’article de Pharmaceutical Technology recommande d’additionner la teneur en peptide, les contre-ions et l’eau. Le résultat devrait approcher 100 %.

Autres essais figurant sur le certificat

• Endotoxines bactériennes. Les endotoxines sont des composants de la paroi cellulaire des bactéries à Gram négatif. On les dose par le test LAL (lysat d’amœbocytes de limule), dont les procédures sont décrites par exemple au chapitre USP <85> de la pharmacopée américaine. Ni l’HPLC ni la MS ne détectent les endotoxines : une pureté élevée n’en dit donc rien.
• Stérilité et pureté microbiologique. Surtout pertinentes pour les substances en solution. Le projet de ligne directrice de l’EMA range la pureté microbiologique parmi les essais types.
• Aspect. Par exemple « poudre lyophilisée blanche » ou « solution limpide et incolore ». Un contrôle simple qui révèle les écarts grossiers.
• Solubilité. Le solvant dans lequel la substance se dissout pour donner une solution limpide.

Signaux d’alerte

• Pas de numéro de lot ni de date de fabrication. Le certificat ne peut pas être rattaché à un conditionnement précis.
• Pas de nom de laboratoire ni de date d’analyse. On ne sait pas qui a réalisé les essais, ni quand.
• Tous les lots ont le même chromatogramme ou les mêmes chiffres. Les résultats se rapportent à un lot précis. Bachem indique expressément que la teneur en peptide est une valeur propre à chaque lot.
• Pas de test d’identité. Une pureté sans spectrométrie de masse montre seulement qu’une substance domine l’échantillon.
• Un résultat d’une perfection irréaliste, comme une pureté d’exactement 100,0 %. La synthèse peptidique produit couramment des sous-produits, et la Pharmacopée européenne fixe le seuil de déclaration des impuretés apparentées aux peptides à 0,1 %. Un résultat sans le moindre pic secondaire mérite des questions.
• La masse théorique ne correspond pas. Comparez-la à une base de données publique comme PubChem.
• Rien n’est vérifiable. Pas de chromatogramme, pas de spectre, pas de contact avec le laboratoire ni de code de vérification.

Un essai réalisé par un laboratoire indépendant, sans lien avec le vendeur, constitue une preuve plus solide. Certains de ces laboratoires, par exemple Janoshik Analytical à Prague, indiquent sur le rapport une clé de vérification qui permet de retrouver le résultat sur le site du laboratoire. Vous pouvez ainsi vérifier que le document correspond à l’enregistrement du laboratoire et n’a pas été modifié après coup. Même pour un essai indépendant, tout ce qui précède reste valable : lot, méthodes, identité et teneur.

Comment cela fonctionne chez Arion Peptides

Nous publions les certificats d’analyse des produits Arion Bios sur la page Certificats. Vous rattachez un certificat à un conditionnement précis grâce à la date de fabrication imprimée sur l’emballage. Pour le lire, vous pouvez utiliser la même liste de contrôle que pour n’importe quel autre certificat d’analyse.

Questions fréquentes

Une pureté de 99 % signifie-t-elle que le flacon contient 99 % de peptide ?

Non. La pureté HPLC exprime la part du peptide recherché parmi les composants peptidiques. Le poids de la poudre comprend aussi des contre-ions et de l’eau, qui ne sont pas pris en compte dans la pureté. La quantité réelle de peptide dans l’échantillon est indiquée par la teneur en peptide.

Pourquoi l’HPLC seule ne suffit-elle pas ?

L’HPLC montre quel pourcentage de l’aire des pics revient au composant principal, mais ne confirme pas de quelle molécule il s’agit. L’identité est établie par la spectrométrie de masse, qui compare la masse mesurée à la masse théorique.

Comment savoir si le certificat correspond à mon conditionnement ?

Cherchez sur le certificat le numéro de lot ou la date de fabrication et comparez-les à l’information figurant sur l’emballage. Pour les produits Arion Bios, le certificat se rattache par la date de fabrication indiquée sur l’emballage.

Pourquoi une pureté de 100,0 % est-elle suspecte ?

La synthèse peptidique produit couramment des sous-produits, et une méthode sensible détecte des impuretés de l’ordre de 0,1 %. Un résultat d’exactement 100,0 % appelle donc une explication sur la méthode et la sensibilité employées.

Sources

1. European Medicines Agency, « Guideline on the Development and Manufacture of Synthetic Peptides » (projet soumis à consultation publique), EMA/CHMP/CVMP/QWP/387541/2023, 2023 : ema.europa.eu
2. Swietlow A, Verlander M, Gregg B, Rode H, Eggen I, Szajek A, « Control Strategies for Synthetic Therapeutic Peptide APIs – Part I: Analytical Consideration », Pharmaceutical Technology, 2014 : pharmtech.com
3. Grosse S, Samonig M, De Pra M, Steiner F, « Impurity profiling of the synthetic peptide LL-37 using high-performance liquid chromatography with combined UV and single quadrupole mass spectrometric detection », Thermo Fisher Scientific, note d’application 72818, 2018 : thermofisher.com
4. D'Hondt M, Bracke N, Taevernier L, Gevaert B, Verbeke F, Wynendaele E, De Spiegeleer B, « Related impurities in peptide medicines », Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2014;101:2–30. DOI : 10.1016/j.jpba.2014.06.012
5. Erckes V, Streuli A, Chamera Rendueles L, Krämer SD, Steuer C, « Towards a Consensus for the Analysis and Exchange of TFA as a Counterion in Synthetic Peptides and Its Influence on Membrane Permeation », Pharmaceuticals, 2025;18(8):1163. DOI : 10.3390/ph18081163
6. Bachem, « What does net peptide content mean? », FAQ technique : bachem.com
7. Bachem, « Peptide Calculator » (pureté et teneur en peptide), Knowledge Center : bachem.com
8. U.S. Food and Drug Administration, « Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers (Edition 2) », Guidance for Industry, 2026 : fda.gov
9. National Center for Biotechnology Information, « PubChem Compound Summary: BPC-157 (CID 9941957) et MOTS-c (CID 146675088) » : pubchem.ncbi.nlm.nih.gov, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov