Liofilizowany peptyd trzeba w laboratorium rozpuścić, zanim zaczniesz z nim pracować. Najczęściej mówi się wtedy o dwóch płynach: o wodzie bakteriostatycznej i o wodzie sterylnej. Na pierwszy rzut oka niczym się nie różnią, obie są przejrzyste i sterylne. Różnica tkwi w jednym dodatku. To on jednak decyduje o tym, jak długo można używać otwartej fiolki i do jakich doświadczeń płyn się nadaje.
Czym jest woda bakteriostatyczna
Farmakopea Stanów Zjednoczonych (USP) definiuje wodę bakteriostatyczną (Bacteriostatic Water for Injection) jako sterylną wodę o jakości farmakopealnej, która zawiera jedną lub więcej odpowiednich substancji przeciwdrobnoustrojowych. Środkiem konserwującym jest zwykle alkohol benzylowy. Na przykład ulotka producenta Hospira opisuje sterylną, apirogenną wodę z 0,9% alkoholu benzylowego (9 mg/ml), a w jednym z opakowań 1,1%. Według tej samej ulotki pH wynosi około 5,7 (zakres 4,5–7,0).
Zgodnie z oficjalną ulotką woda bakteriostatyczna jest przeznaczona wyłącznie do rozcieńczania lub rozpuszczania innych preparatów. Jest więc rozpuszczalnikiem (po angielsku diluent), a nie samodzielnym preparatem. Farmakopea dodatkowo wyraźnie zaznacza, że trzeba brać pod uwagę zgodność środka konserwującego z rozpuszczaną substancją. Wrócimy do tego jeszcze.
Słowo „bakteriostatyczny” oznacza, że substancja hamuje wzrost i namnażanie się bakterii. Nie oznacza, że niezawodnie je zabija. Substancje, które zabijają bakterie, nazywa się bakteriobójczymi. Amerykańskie Centra Kontroli i Prewencji Chorób (CDC) piszą o fiolkach wielodawkowych, że środek konserwujący pomaga ograniczać wzrost bakterii, ale nie działa na wirusy i nie chroni w pełni przed skażeniem. Woda bakteriostatyczna nie zastępuje więc pracy aseptycznej.
Czym jest woda sterylna
Farmakopea Europejska opisuje w monografii Woda do wstrzykiwań (0169) dwie postacie tej wody. Woda „luzem” (in bulk) służy jako nośnik przy produkcji leków. Woda sterylizowana (sterylizowana woda do wstrzykiwań) jest przeznaczona do rozpuszczania lub rozcieńczania innych preparatów. Tak podsumowują to również wytyczne Europejskiej Agencji Leków (EMA) dotyczące jakości wody do celów farmaceutycznych. Farmakopea amerykańska ma analogiczny preparat pod nazwą Sterile Water for Injection.
Najważniejsze jest to, czego woda sterylna nie zawiera. Ulotka Hospira podaje, że nie ma w niej żadnej substancji bakteriostatycznej ani przeciwdrobnoustrojowej ani dodanego buforu i że jest dostarczana wyłącznie w opakowaniach jednodawkowych. Zalecenie producenta jest jednoznaczne: nie używać ponownie opakowań jednodawkowych, a niewykorzystaną resztę wyrzucić.
Powód jest prosty. Gdy tylko fiolka zostanie otwarta lub przekłuta, mogą się do niej dostać mikroorganizmy. Bez środka konserwującego nic nie hamuje ich wzrostu. Woda sterylna jest więc „czystsza” w tym sensie, że poza wodą nic nie zawiera. Po otwarciu traktuje się ją jednak jako jednorazową.
Po co środek konserwujący: opakowania wielodawkowe
Woda bakteriostatyczna jest dostarczana w opakowaniach wielodawkowych, z których według ulotki można wielokrotnie pobierać płyn. Właśnie dlatego zawiera środek konserwujący. Farmakopea amerykańska przewiduje dla niej szklane opakowania o pojemności nie większej niż 30 ml.
Nawet środek konserwujący nie oznacza jednak nieograniczonej przydatności po otwarciu. W amerykańskiej ochronie zdrowia i w aptekach opakowania wielodawkowe podlegają zaleceniu rozdziału USP <797>, które streszcza także CDC: po pierwszym otwarciu (na przykład przekłuciu korka) fiolkę oznacza się datą i wyrzuca najpóźniej po 28 dniach, chyba że producent podaje dla otwartej fiolki inny termin, krótszy lub dłuższy. Według CDC fiolki jednodawkowe zwykle nie zawierają środka konserwującego.
Podajemy to jako przykład ogólnej praktyki dla opakowań wielodawkowych, a nie jako instrukcję. W laboratorium zawsze decydują dane producenta na etykiecie konkretnego preparatu i wewnętrzne procedury (SOP) twojego laboratorium.
Kiedy alkohol benzylowy może przeszkadzać w laboratorium
Alkohol benzylowy nie jest obojętnym dodatkiem. W niektórych sytuacjach może wpłynąć na rozpuszczaną substancję lub na wynik doświadczenia.
Białka i agregacja. Środki konserwujące w wielodawkowych preparatach białkowych są znane z tego, że mogą sprzyjać agregacji (zlepianiu się) białek. Badanie z 2014 roku porównało cztery popularne środki konserwujące na interferonie alfa-2a. Wszystkie wywołały agregację, a alkohol benzylowy zajął trzecie miejsce, za m-krezolem i fenolem. W innej pracy badano liofilizowane białko (antagonistę receptora interleukiny 1), które naukowcy rozpuszczali w wodzie albo w roztworze z 0,9% alkoholu benzylowego. Z alkoholem benzylowym powstawało więcej agregatów. Ich ilość zależała od tego, jak dobrze białko zachowało swoją strukturę podczas liofilizacji.
Te badania dotyczą białek, a nie krótkich peptydów, i ich wyników nie można automatycznie przenosić. Zachowanie każdej substancji zależy od jej sekwencji. Nie można więc zakładać, że alkohol benzylowy jest zgodny z każdą substancją.
Hodowle komórkowe i czułe testy. Alkohol benzylowy działa na błony komórkowe. W doświadczeniach na hodowanych komórkach śródbłonka zwiększał płynność błon zależnie od dawki, a przy stężeniu 50 mmol/l wyraźnie zwiększył przepuszczalność warstwy komórek. Dla porównania: 0,9% alkoholu benzylowego odpowiada około 83 mmol/l. Po rozcieńczeniu w podłożu hodowlanym stężenie jest oczywiście niższe. W czułych testach komórkowych warto jednak rozważyć rozpuszczalnik bez środka konserwującego albo przynajmniej dodać kontrolę z samym rozpuszczalnikiem.
Rozpuszczalność. Nie każdy peptyd dobrze rozpuszcza się w wodzie, ze środkiem konserwującym czy bez niego. Dostawcy peptydów, na przykład GenScript i Bachem, opisują w swoich poradnikach ogólne postępowanie:
- rozpuszczalność najpierw sprawdź na małej ilości substancji,
- przy krótkich peptydach spróbuj najpierw wody sterylnej,
- peptydy zasadowe (o całkowitym ładunku dodatnim) rozpuść w małej ilości rozcieńczonego kwasu octowego, a potem rozcieńcz,
- peptydy kwasowe (o całkowitym ładunku ujemnym) rozpuść w małej ilości rozcieńczonego amoniaku; przy peptydach z cysteiną GenScript tego nie zaleca,
- peptydy hydrofobowe i obojętne rozpuść w małej ilości rozpuszczalnika organicznego, zwykle DMSO, i dopiero potem rozcieńcz wodą lub buforem.
Bachem zwraca też uwagę, że wysokie stężenia rozpuszczalników organicznych nie są zgodne z układami biologicznymi, takimi jak komórki. Według Bachem nie istnieje uniwersalny protokół dla wszystkich peptydów. Wybór rozpuszczalnika zależy więc od protokołu doświadczenia i od danych o rozpuszczalności, jeśli dostawca podaje je w karcie technicznej lub w certyfikacie analizy.
Rozpuszczanie liofilizowanego peptydu: ogólne zasady
Poniższe punkty opisują ogólną praktykę laboratoryjną. Ilości i stężenia zawsze określa protokół konkretnego doświadczenia.
- Pozwól fiolce ogrzać się do temperatury pokojowej. Peptydy są często higroskopijne. Bachem zaleca więc, by zamknięty pojemnik osiągnął temperaturę otoczenia, najlepiej w eksykatorze, i dopiero wtedy go otworzyć. Pochłonięta wilgoć zmniejsza zawartość peptydu i może pogorszyć jego stabilność.
- Pracuj aseptycznie. Przetrzyj korki fiolki z peptydem i fiolki z rozpuszczalnikiem gazikiem nasączonym alkoholem i odczekaj, aż wyschną. Używaj sterylnych akcesoriów jednorazowych.
- Dodawaj rozpuszczalnik powoli po ściance fiolki, a nie bezpośrednim strumieniem na liofilizat.
- Delikatnie zakręć fiolką, nie wstrząsaj. Obciążenie mechaniczne, na przykład energiczne wstrząsanie, należy do opisanych czynników, które mogą wywołać agregację białek. Jeśli część substancji pozostaje nierozpuszczona, Bachem wspomina o kilkuminutowym zanurzeniu w łaźni ultradźwiękowej.
- Sprawdź wygląd. Roztwór powinien być przejrzysty, bez zmętnienia i bez widocznych cząstek. Zmętnienie może oznaczać niepełne rozpuszczenie lub agregację. W takim przypadku lepiej wrócić do danych dostawcy o rozpuszczalności, niż kontynuować.
- Oznacz fiolkę nazwą substancji, użytym rozpuszczalnikiem i datą przygotowania.
Przechowywanie otwartej wody bakteriostatycznej i gotowych roztworów
Woda bakteriostatyczna. Ulotka Hospira podaje przechowywanie w temperaturze 20–25 °C. Wodę bakteriostatyczną z naszej oferty przechowuje się w temperaturze pokojowej i chroni przed światłem. Zawsze obowiązują dane na etykiecie konkretnego preparatu. Po pierwszym otwarciu warto zapisać datę na fiolce.
Ulotka wyraźnie podaje, że przy jednorazowym i wielokrotnym pobieraniu z fiolki trzeba pracować aseptycznie. W praktyce oznacza to przetarcie korka gazikiem z alkoholem przed każdym pobraniem i odczekanie, aż wyschnie, użycie nowego sterylnego akcesorium i niewlewanie niczego z powrotem do fiolki. Zgodnie z ogólną zasadą nie używa się zawartości mętnej ani zawierającej widoczne cząstki.
Gotowe roztwory peptydów. Bachem zaleca, by nie przechowywać peptydów w roztworze długoterminowo, nawet w roztworze sterylnym. Jeśli nie da się tego uniknąć, radzi podzielić roztwór na mniejsze porcje (alikwoty). Według Bachem krótszą trwałość mają peptydy zawierające asparaginę, glutaminę, metioninę, cysteinę lub tryptofan. Konkretne warunki przechowywania zawsze określa dostawca danej substancji. Dla produktów Arion Bios obowiązują wskazówki podane przy produkcie: przechowywać w temperaturze 2–8 °C, chronić przed światłem, nie zamrażać i trzymać w oryginalnym zamkniętym opakowaniu.
Porównanie: woda bakteriostatyczna a woda sterylna
| Cecha | Woda bakteriostatyczna | Woda sterylna |
|---|---|---|
| Skład | Sterylna woda o jakości farmakopealnej ze środkiem konserwującym, zwykle 0,9% alkoholu benzylowego | Sterylna woda o jakości farmakopealnej bez dodatków |
| Środek konserwujący | Tak – hamuje wzrost bakterii, nie zabija ich niezawodnie, nie działa na wirusy | Nie |
| Opakowanie | Wielodawkowe, pozwala na wielokrotne pobieranie | Jednodawkowe |
| Po otwarciu | Wielokrotne pobieranie w warunkach aseptycznych; termin określa producent (ogólna praktyka dla opakowań wielodawkowych: 28 dni, chyba że producent podaje inaczej) | Niewykorzystaną resztę się wyrzuca |
| Typowe zastosowanie w laboratorium | Rozpuszczanie substancji zgodnych z alkoholem benzylowym, gdy z jednej fiolki rozpuszczalnika pobiera się wielokrotnie | Doświadczenia, w których środek konserwujący by przeszkadzał (czułe hodowle komórkowe i testy, substancje podatne na agregację), oraz jednorazowe przygotowanie roztworu |
| Ograniczenia | Alkohol benzylowy może sprzyjać agregacji białek, działa na błony komórkowe i może wpływać na niektóre testy | Po otwarciu brak ochrony przed wzrostem drobnoustrojów |
Woda bakteriostatyczna w ofercie Arion Peptides
Wodę bakteriostatyczną oferujemy jako akcesorium laboratoryjne do liofilizowanych peptydów badawczych: woda bakteriostatyczna. Tak jak wszystkie nasze produkty jest przeznaczona wyłącznie do celów laboratoryjnych i badawczych. Certyfikaty analizy dla partii peptydów Arion Bios znajdziesz na stronie certyfikatów analizy.
Najczęstsze pytania
Czy woda bakteriostatyczna to to samo co woda sterylna?
Nie. Podstawa jest ta sama: sterylna woda o jakości farmakopealnej. Woda bakteriostatyczna zawiera dodatkowo środek konserwujący, zwykle 0,9% alkoholu benzylowego, i jest dostarczana w opakowaniu wielodawkowym. Woda sterylna nie zawiera żadnych dodatków i po otwarciu jest przeznaczona do jednorazowego użycia.
Czy woda bakteriostatyczna zabija bakterie?
Nie w sposób niezawodny. Środek konserwujący hamuje wzrost i namnażanie się bakterii, ale nie jest środkiem dezynfekującym. Według CDC nie działa na wirusy i nie chroni w pełni przed skażeniem. Praca aseptyczna jest więc konieczna także w jej przypadku.
Jak długo można używać otwartej fiolki wody bakteriostatycznej?
Decydują dane producenta na etykiecie. W ochronie zdrowia dla opakowań wielodawkowych stosuje się zwykle termin 28 dni od pierwszego otwarcia według USP <797>, chyba że producent podaje inaczej. Woda sterylna bez środka konserwującego jest jednodawkowa, a jej resztę po otwarciu się wyrzuca.
Kiedy wybrać wodę sterylną albo inny rozpuszczalnik?
Tam, gdzie alkohol benzylowy mógłby wpłynąć na wynik, na przykład w czułych hodowlach komórkowych i testach albo przy substancjach podatnych na agregację. Inny rozpuszczalnik może być potrzebny także ze względu na samą rozpuszczalność substancji, na przykład rozcieńczony kwas octowy przy peptydach zasadowych lub DMSO przy hydrofobowych. Decydują protokół doświadczenia i dane dostawcy.
Źródła
- Hospira, Inc. (Pfizer), „Bacteriostatic Water for Injection, USP”, ulotka (prescribing information): labeling.pfizer.com
- Hospira, Inc. (Pfizer), „Sterile Water for Injection, USP”, ulotka (prescribing information): labeling.pfizer.com
- United States Pharmacopeia, „Bacteriostatic Water for Injection”, monografia, USP 38–NF 33, 2015: drugfuture.com
- Europejska Agencja Leków (EMA), „Guideline on the quality of water for pharmaceutical use”, EMA/CHMP/CVMP/QWP/496873/2018, 2020 (z odwołaniem do monografii Ph. Eur. 0169 Woda do wstrzykiwań): ema.europa.eu
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC), „Preventing Unsafe Injection Practices”, streszczenie zaleceń USP <797> dla fiolek wielodawkowych i jednodawkowych: cdc.gov
- Bis RL, Mallela KMG, „Antimicrobial preservatives induce aggregation of interferon alpha-2a: the order in which preservatives induce protein aggregation is independent of the protein”, International Journal of Pharmaceutics, 2014;472:356–361. DOI: 10.1016/j.ijpharm.2014.06.044
- Roy S, Jung R, Kerwin BA, Randolph TW, Carpenter JF, „Effects of benzyl alcohol on aggregation of recombinant human interleukin-1-receptor antagonist in reconstituted lyophilized formulations”, Journal of Pharmaceutical Sciences, 2005;94(2):382–396. DOI: 10.1002/jps.20258
- Mahler HC, Friess W, Grauschopf U, Kiese S, „Protein aggregation: pathways, induction factors and analysis”, Journal of Pharmaceutical Sciences, 2009;98(9):2909–2934. DOI: 10.1002/jps.21566
- Alvarado A, Butterfield DA, Hennig B, „Disruption of endothelial barrier function: relationship to fluidity of membrane extracellular lamella”, International Journal of Biochemistry, 1994;26(4):575–581. DOI: 10.1016/0020-711x(94)90016-7
- GenScript, „Peptide Solubility Guidelines”, poradnik techniczny: genscript.com
- Bachem, „Handling and Storage Guidelines for Peptides”, Knowledge Center: bachem.com