Certyfikat analizy peptydu: jak czytać CoA i czystość HPLC

Biały liofilizowany proszek zawsze wygląda tak samo. Czy to czysty peptyd, mieszanina z produktami ubocznymi syntezy, czy zupełnie inna cząsteczka, gołym okiem nie odróżnisz. O tym, co naprawdę jest w fiolce, mówią tylko badania laboratoryjne. W tym poradniku krok po kroku omawiamy certyfikat analizy.

Czym jest certyfikat analizy i dlaczego ma znaczenie

Certyfikat analizy (po angielsku certificate of analysis, w skrócie CoA) to raport z wynikami badań jednej konkretnej serii substancji. Podaje, jakimi metodami badano próbkę, co zmierzono i czy wyniki spełniły ustalone wcześniej limity.

Dla badań ma to praktyczne znaczenie. Peptydy syntetyczne produkuje się seriami, a podczas syntezy powstają produkty uboczne: peptydy z brakującym lub dodatkowym aminokwasem, formy utlenione, pozostałości grup ochronnych albo niepożądane przeciwjony. Praca przeglądowa w czasopiśmie Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis zwraca uwagę, że takie zanieczyszczenia mogą zniekształcić wyniki wczesnych badań laboratoryjnych i prowadzić do błędnych wniosków. Jeśli chcesz, żeby eksperyment dało się powtórzyć, musisz wiedzieć, z jaką substancją i o jakiej jakości masz do czynienia.

Co powinien zawierać prawidłowy certyfikat

Format różni się w zależności od producenta i laboratorium. Wiarygodny certyfikat powinien jednak zawierać co najmniej te dane:

• nazwę substancji, najlepiej z sekwencją lub wzorem sumarycznym,
• numer serii (batch, lot) lub datę produkcji, dzięki której przypiszesz certyfikat do konkretnego opakowania,
• datę analizy,
• nazwę laboratorium, które wykonało badania,
• zastosowane metody, na przykład RP-HPLC z detekcją UV i spektrometrię mas,
• wyniki razem z kryteriami akceptacji, czyli co zmierzono i jaki limit próbka miała spełnić (na przykład „czystość ≥ 98%”),
• podpis lub inny sposób weryfikacji, np. nazwisko osoby odpowiedzialnej albo kod weryfikacyjny.

Dużą zaletą są dołączone surowe dane, czyli chromatogram i widmo masowe. Samą liczbę bez wykresu sprawdza się znacznie trudniej.

Projekt wytycznej Europejskiej Agencji Leków (EMA) dotyczącej peptydów syntetycznych przewiduje dla substancji leczniczych jeszcze szerszą listę: oprócz tożsamości i czystości także zawartość peptydu, przeciwjony, wodę, endotoksyny i czystość mikrobiologiczną. Certyfikat substancji badawczej nie musi obejmować wszystkiego, ale lista pokazuje, o co warto pytać.

Czystość HPLC: co oznacza „procent powierzchni”

Najczęstszą informacją na certyfikacie jest czystość oznaczona metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), zwykle w układzie faz odwróconych (RP-HPLC). Próbka przechodzi przez kolumnę, która rozdziela jej składniki, a detektor na wyjściu mierzy absorpcję światła ultrafioletowego (UV). Wynikiem jest chromatogram: krzywa z pikami, w której każdy pik odpowiada jednej lub kilku substancjom.

W przypadku peptydów detekcję UV ustawia się zwykle na długość fali około 214 nm. Przy niej silnie absorbuje wiązanie peptydowe, czyli wiązanie między aminokwasami, które ma każdy peptyd. Detektor rejestruje więc główny peptyd i większość zanieczyszczeń peptydowych.

Czystość oblicza się jako procent powierzchni (area %): powierzchnię piku poszukiwanego peptydu dzieli się przez sumę powierzchni wszystkich zarejestrowanych pików. Czystość 98,5% oznacza więc, że główny pik stanowi 98,5% całkowitej powierzchni pików przy danej długości fali.

To przydatna liczba, ale ma swoje granice. Czystość HPLC:

• nie dowodzi tożsamości. Pokazuje tylko, że w próbce przeważa jeden składnik, a nie że jest to właściwa cząsteczka.
• może nie wykryć zanieczyszczeń o tym samym czasie retencji co główny pik. Nota aplikacyjna Thermo Fisher Scientific wyraźnie stwierdza, że takich współeluujących zanieczyszczeń nie da się wykluczyć na podstawie samego zapisu UV.
• nie jest dokładnym bilansem masy. Różne peptydy nie mają tej samej odpowiedzi UV, więc powierzchnia piku nie zawsze dokładnie odpowiada masie.
• nic nie mówi o ilości. Czystość wyraża udział poszukiwanego peptydu wśród składników peptydowych. Woda i sole nie są w niej uwzględniane.

Spektrometria mas: czy to naprawdę właściwa cząsteczka?

Tożsamość, czyli to, że w fiolce jest deklarowany peptyd, potwierdza spektrometria mas (MS). W przypadku peptydów stosuje się zwykle jonizację przez elektrorozpylanie (ESI-MS), często połączoną bezpośrednio z chromatografią (LC-MS). Aparat nie waży cząsteczek bezpośrednio. Mierzy stosunek masy do ładunku, oznaczany m/z.

Podczas jonizacji peptyd przyłącza jeden lub kilka protonów. Jedna cząsteczka może więc pojawić się w widmie jako kilka pików: z jednym ładunkiem ([M+H]⁺), z dwoma ([M+2H]²⁺) i tak dalej. Z każdego piku można przeliczyć masę cząsteczki według wzoru M = z × (m/z − 1,007), gdzie z to liczba ładunków, a 1,007 to masa protonu.

Przykład: według bazy PubChem BPC-157 ma wzór C₆₂H₉₈N₁₆O₂₂ i masę cząsteczkową 1419,5 g/mol. W widmie powinny więc pojawić się mniej więcej takie wartości (obliczone z masy średniej i zaokrąglone):

W przypadku MOTS-c o masie 2174,6 g/mol jon dwukrotnie naładowany leżałby w okolicy m/z 1088,3, a trzykrotnie naładowany w okolicy 725,9.

Na certyfikacie powinna być podana masa teoretyczna i zmierzona, a obie powinny być zgodne. Artykuł o kontroli peptydów syntetycznych w czasopiśmie Pharmaceutical Technology podaje jako przykład wymóg, by zmierzona masa monoizotopowa różniła się od teoretycznej najwyżej o ±1,0 jednostki masy. Uważaj na dwa rodzaje masy: masa średnia (dla BPC-157 1419,5) uwzględnia naturalny rozkład izotopów, a monoizotopowa (około 1418,7) tylko najlżejsze izotopy. Aparaty o niższej rozdzielczości podają zwykle masę średnią, a aparaty wysokorozdzielcze masę monoizotopową.

Sama masa nie mówi jednak wszystkiego. Peptyd z tymi samymi aminokwasami w innej kolejności ma taką samą masę. Dlatego do potwierdzenia sekwencji stosuje się fragmentację (MS/MS), a projekt wytycznej EMA zaleca do identyfikacji peptydu co najmniej dwie niezależne (ortogonalne) metody, na przykład LC-MS i analizę aminokwasów.

Czystość to nie zawartość: ile peptydu jest w fiolce

Tu powstaje najczęstsze nieporozumienie. Czystość mówi, jaką część materiału peptydowego stanowi poszukiwany peptyd. Zawartość peptydu (po angielsku net peptide content) mówi, jaką część całkowitej masy proszku stanowi w ogóle materiał peptydowy. Reszta przypada na przeciwjony i resztkową wodę.

Przeciwjony trafiają do peptydu podczas produkcji. Kwas trifluorooctowy (TFA) służy do odszczepienia gotowego peptydu w syntezie na fazie stałej, a także jako dodatek przy oczyszczaniu metodą HPLC. Po liofilizacji peptyd pozostaje w postaci soli z trifluorooctanem. Badanie z 2025 roku wykazało w badanych peptydach zawartość TFA sięgającą 35% całkowitej masy soli. Według EMA w peptydach syntetycznych zwykle stosuje się octan jako przeciwjon, ale octan też nie jest peptydem. Do tego liofilizowany proszek wiąże wodę.

Masa proszku składa się więc z peptydu, przeciwjonów i wody. Producent peptydów Bachem podaje przykład z zawartością peptydu 85%: z 1 mg proszku na materiał peptydowy przypada 0,85 mg. Do tej części wliczają się przy tym również zanieczyszczenia peptydowe. Bachem zaznacza też, że dwie próbki o tej samej czystości 95% mogą zawierać różne ilości docelowego peptydu, jeśli różnią się zawartością (na przykład 80% i 95%).

Dlatego fiolka o czystości 99% może zawierać mniej niż 10 mg peptydu, nawet jeśli na etykiecie podano 10 mg. Zależy to od tego, czy podana wartość dotyczy masy proszku, czy czystej zawartości peptydu. Dobry certyfikat albo wyraźnie to określa, albo zawiera osobną informację o zawartości lub ilości peptydu.

Zawartość peptydu oznacza się na przykład:

• analizą aminokwasów, w której peptyd rozkłada się na pojedyncze aminokwasy, a następnie się je mierzy,
• analizą elementarną azotu, ponieważ ani przeciwjony, ani woda nie zawierają azotu,
• ilościową HPLC względem wzorca odniesienia o znanej zawartości.

Zawartość przeciwjonów mierzy się na przykład chromatografią jonową. Artykuł w Pharmaceutical Technology zaleca zsumowanie zawartości peptydu, przeciwjonów i wody. Wynik powinien zbliżać się do 100%.

Inne badania na certyfikacie

• Endotoksyny bakteryjne. Endotoksyny są składnikami ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych. Oznacza się je testem LAL (lizat amebocytów skrzypłocza), a procedury opisuje na przykład amerykańska farmakopea w rozdziale USP <85>. Ani HPLC, ani MS nie wykrywają endotoksyn, więc wysoka czystość nic o nich nie mówi.
• Jałowość i czystość mikrobiologiczna. Istotne głównie w przypadku substancji w roztworze. Projekt wytycznej EMA zalicza czystość mikrobiologiczną do typowych badań.
• Wygląd. Na przykład „biały liofilizowany proszek” albo „klarowny bezbarwny roztwór”. Prosta kontrola, która ujawnia rażące odchylenia.
• Rozpuszczalność. Informacja, w jakim rozpuszczalniku substancja rozpuszcza się do klarownego roztworu.

Sygnały ostrzegawcze

• Brak numeru serii lub daty produkcji. Certyfikatu nie da się przypisać do konkretnego opakowania.
• Brak nazwy laboratorium lub daty analizy. Nie wiadomo, kto i kiedy wykonał badania.
• Wszystkie serie mają ten sam chromatogram lub te same liczby. Wyniki dotyczą konkretnej serii. Bachem wprost podaje, że zawartość peptydu jest wartością specyficzną dla serii.
• Brak badania tożsamości. Czystość bez spektrometrii mas pokazuje tylko, że w próbce przeważa jedna substancja.
• Nierealnie idealny wynik, na przykład czystość dokładnie 100,0%. Podczas syntezy peptydów rutynowo powstają produkty uboczne, a Farmakopea Europejska ustala próg raportowania zanieczyszczeń pokrewnych peptydom na 0,1%. Wynik bez ani jednego piku bocznego budzi pytania.
• Masa teoretyczna się nie zgadza. Porównaj ją z publiczną bazą danych, na przykład PubChem.
• Niczego nie da się sprawdzić. Brak chromatogramu, widma, kontaktu do laboratorium i kodu weryfikacyjnego.

Mocniejszym dowodem jest badanie w niezależnym laboratorium, niepowiązanym ze sprzedawcą. Niektóre takie laboratoria, na przykład Janoshik Analytical w Pradze, podają na raporcie klucz weryfikacyjny, dzięki któremu wynik można odnaleźć na stronie laboratorium. W ten sposób sprawdzisz, czy dokument odpowiada zapisowi laboratorium i nie został później zmieniony. Nawet przy niezależnym badaniu obowiązuje jednak wszystko, o czym była mowa wyżej: seria, metody, tożsamość i zawartość.

Jak to działa w Arion Peptides

Certyfikaty analizy produktów Arion Bios publikujemy na stronie Certyfikaty. Do konkretnego opakowania przypiszesz certyfikat na podstawie daty produkcji wydrukowanej na opakowaniu. Czytając go, możesz korzystać z tej samej listy kontrolnej co przy każdym innym certyfikacie.

Najczęściej zadawane pytania

Czy czystość 99% oznacza, że w fiolce jest 99% peptydu?

Nie. Czystość HPLC wyraża udział poszukiwanego peptydu wśród składników peptydowych. Masa proszku obejmuje też przeciwjony i wodę, których nie uwzględnia się w czystości. Ile peptydu naprawdę jest w próbce, pokazuje dopiero zawartość peptydu.

Dlaczego samo HPLC nie wystarczy?

HPLC pokazuje, jaki procent powierzchni pików przypada na główny składnik, ale nie potwierdza, o jaką cząsteczkę chodzi. Tożsamość potwierdza spektrometria mas, która porównuje zmierzoną masę z teoretyczną.

Skąd mam wiedzieć, że certyfikat dotyczy mojego opakowania?

Poszukaj na certyfikacie numeru serii lub daty produkcji i porównaj je z informacją na opakowaniu. W przypadku produktów Arion Bios certyfikat przypisuje się na podstawie daty produkcji na opakowaniu.

Dlaczego czystość 100,0% jest podejrzana?

Podczas syntezy peptydów rutynowo powstają produkty uboczne, a czuła metoda wykrywa zanieczyszczenia na poziomie około 0,1%. Wynik równy dokładnie 100,0% wymaga więc wyjaśnienia, jaką metodą i z jaką czułością go uzyskano.

Źródła

1. European Medicines Agency, „Guideline on the Development and Manufacture of Synthetic Peptides” (projekt do konsultacji publicznych), EMA/CHMP/CVMP/QWP/387541/2023, 2023: ema.europa.eu
2. Swietlow A, Verlander M, Gregg B, Rode H, Eggen I, Szajek A, „Control Strategies for Synthetic Therapeutic Peptide APIs – Part I: Analytical Consideration”, Pharmaceutical Technology, 2014: pharmtech.com
3. Grosse S, Samonig M, De Pra M, Steiner F, „Impurity profiling of the synthetic peptide LL-37 using high-performance liquid chromatography with combined UV and single quadrupole mass spectrometric detection”, Thermo Fisher Scientific, nota aplikacyjna 72818, 2018: thermofisher.com
4. D'Hondt M, Bracke N, Taevernier L, Gevaert B, Verbeke F, Wynendaele E, De Spiegeleer B, „Related impurities in peptide medicines”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2014;101:2–30. DOI: 10.1016/j.jpba.2014.06.012
5. Erckes V, Streuli A, Chamera Rendueles L, Krämer SD, Steuer C, „Towards a Consensus for the Analysis and Exchange of TFA as a Counterion in Synthetic Peptides and Its Influence on Membrane Permeation”, Pharmaceuticals, 2025;18(8):1163. DOI: 10.3390/ph18081163
6. Bachem, „What does net peptide content mean?”, techniczne FAQ: bachem.com
7. Bachem, „Peptide Calculator” (czystość i zawartość peptydu), Knowledge Center: bachem.com
8. U.S. Food and Drug Administration, „Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers (Edition 2)”, Guidance for Industry, 2026: fda.gov
9. National Center for Biotechnology Information, „PubChem Compound Summary: BPC-157 (CID 9941957) i MOTS-c (CID 146675088)”: pubchem.ncbi.nlm.nih.gov, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov