Certyfikat analizy opisuje stan peptydu w dniu, w którym go zbadano. To, czy zawartość fiolki będzie mu odpowiadać także w dniu eksperymentu, w dużej mierze zależy od przechowywania. Peptydy to wrażliwe cząsteczki. Ciepło, wilgoć, światło czy wielokrotne zamrażanie mogą je stopniowo uszkadzać, często bez widocznych zmian.
Ten poradnik podsumowuje, co o przechowywaniu peptydów mówią przeglądy naukowe i techniczne poradniki dostawców peptydów laboratoryjnych. Ogólne zalecenia to jednak nie to samo co instrukcja konkretnego produktu, dlatego przechowywanie produktów Arion Bios opisujemy osobno.
Dlaczego peptydy się rozkładają
Peptyd to krótki łańcuch aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi. Te wiązania i grupy boczne aminokwasów mogą reagować z wodą, z tlenem albo ze sobą nawzajem. Literatura naukowa rozróżnia niestabilność chemiczną, przy której powstają lub pękają wiązania kowalencyjne, oraz niestabilność fizyczną, przy której zmienia się kształt i zachowanie cząsteczek. Najczęstsze drogi rozkładu to:
- Hydroliza – woda rozcina wiązanie peptydowe. Szybkość reakcji silnie zależy od pH.
- Utlenianie – najłatwiej utleniają się aminokwasy zawierające siarkę, czyli metionina (Met) i cysteina (Cys). Wrażliwe są też aminokwasy aromatyczne, na przykład tryptofan (Trp). Utlenianie wywołują tlen, śladowe ilości metali i światło.
- Deamidacja – asparagina (Asn) i glutamina (Gln) tracą grupę amidową. W glutaminie zachodzi to znacznie wolniej. Szybkość zależy głównie od pH i temperatury.
- Agregacja – cząsteczki zlepiają się ze sobą. Częściej występuje przy wyższym stężeniu. Może ją wywołać także zamrożenie, podgrzanie lub wstrząsanie.
- Adsorpcja – część peptydu przywiera do ścianki naczynia. Zależy to od materiału opakowania i od składu peptydu.
Wyższa temperatura przyspiesza większość tych reakcji, dlatego peptydy zwykle przechowuje się i transportuje w chłodzie. Inne czynniki to wilgoć, światło i pH. W przypadku roztworów dochodzi ryzyko skażenia mikrobiologicznego. To, która droga rozkładu przeważa, zależy głównie od składu i sekwencji aminokwasów. Bachem podaje na przykład, że peptydy zawierające Asn, Gln, Met, Cys lub Trp mają ograniczoną trwałość.
Liofilizowany proszek: najbardziej stabilna postać
Liofilizacja to suszenie przez zamrażanie. Peptyd się zamraża, a wodę usuwa w próżni. Powstaje suchy proszek albo zwarty „placek” na dnie fiolki. Bez wody wyraźnie zwalniają reakcje, które jej potrzebują, na przykład hydroliza. Dlatego w rozwoju leków białka często przeprowadza się w postać stałą, aby uzyskać akceptowalny okres trwałości. Jednak nawet w stanie stałym nie są one stabilne bez końca.
Dostawcy peptydów laboratoryjnych podają dla liofilizatu podobne zasady:
- Długoterminowo w zamrażarce. Sigma-Aldrich zaleca −20 °C, a przy dłuższym przechowywaniu raczej −80 °C. Bachem podaje temperaturę poniżej −15 °C, najlepiej −50 °C lub niższą. Według GenScript większość liofilizowanych peptydów zachowuje stabilność w −20 °C przez kilka lat.
- Krótkoterminowo w lodówce. Bachem dopuszcza do krótkotrwałego użytku lodówkę o temperaturze 4 °C. Sigma-Aldrich podaje, że niektóre peptydy są stabilne w 4 °C.
- W suchym miejscu i szczelnie zamknięte. Peptydy bywają higroskopijne, czyli przyciągają wilgoć z powietrza. Pochłonięta woda zmniejsza zawartość peptydu w odważonej ilości i może obniżyć stabilność. Szczególnie podatne są peptydy z Asp, Glu, Lys, Arg lub His.
- Przed otwarciem doprowadź do temperatury pokojowej. Zamknięta fiolka wyjęta z chłodu powinna najpierw osiągnąć temperaturę pokojową, najlepiej w eksykatorze. W przeciwnym razie na zimnym proszku skropli się wilgoć z powietrza.
- Z dala od jasnego światła. GenScript zaleca przechowywanie liofilizatu w miejscu chronionym przed jasnym światłem.
Te wartości pochodzą z poradników dla peptydów badawczych syntetyzowanych na zamówienie. Opisują ogólną praktykę laboratoryjną, a nie warunki dla konkretnego gotowego produktu.
Peptydy w roztworze: krótsza trwałość
Do tej grupy należą zarówno napełnione pióra, jak i każdy peptyd rozpuszczony w laboratorium. W wodzie może zachodzić hydroliza, deamidacja i agregacja, dlatego roztwór jest mniej stabilny niż proszek. GenScript podaje, że trwałość peptydów w roztworze jest bardzo ograniczona. Bachem nie zaleca długotrwałego przechowywania roztworów. Thermo Fisher dodaje, że im niższe stężenie, tym mniej stabilny roztwór.
- Chłodzenie w 2–8 °C. Według ogólnego poradnika Sigma-Aldrich roztwory peptydów wytrzymują w 4 °C zwykle najwyżej około tygodnia. Roztwory peptydów z Asn, Gln, Cys, Met lub Trp są mniej stabilne.
- Ochrona przed światłem. Wiele peptydów jest wrażliwych na światło. Utlenianie wywołane światłem dotyczy głównie aminokwasów aromatycznych.
- Bez wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. Każdy cykl obciąża peptyd, a samo zamrożenie może wywołać agregację. W laboratoriach roztwór przeznaczony do dłuższego przechowywania dzieli się więc na jednorazowe porcje (alikwoty), żeby każdą rozmrażać tylko raz.
- Praca w warunkach sterylnych. Dostawcy zalecają sterylną wodę lub bufory, pracę w rękawiczkach i w razie potrzeby filtrację przez filtr 0,2 µm, aby do roztworu nie dostały się bakterie.
Produkty Arion Bios: liczy się etykieta, nie zamrażaj
Powyższe zalecenia pochodzą głównie od producentów peptydów na zamówienie, dla których zamrażanie alikwotów to laboratoryjna rutyna. W przypadku produktów Arion Bios obowiązuje instrukcja podana przy produkcie i na opakowaniu:
- przechowuj w temperaturze 2–8 °C,
- chroń przed światłem,
- nie zamrażaj,
- trzymaj w oryginalnym, zamkniętym opakowaniu.
Dlaczego instrukcja konkretnego produktu może różnić się od ogólnych zasad? Warunki przechowywania na etykiecie wynikają z badań stabilności danego produktu w danym opakowaniu. Tę samą zasadę opisują wytyczne Europejskiej Agencji Leków (EMA) dotyczące deklarowania warunków przechowywania: dla produktów stabilnych w 5 ± 3 °C przewidują zapis „przechowywać w lodówce (2–8 °C)”, w razie potrzeby uzupełniony o „nie zamrażać”. Niskie temperatury mogą bowiem wywołać zmiany fizyczne w niektórych postaciach lub wpłynąć na opakowanie.
Zasada jest więc prosta: etykieta i instrukcja konkretnego produktu zawsze mają pierwszeństwo przed ogólnymi zaleceniami, także przed tymi z tego artykułu. Nie wkładaj więc piór ani fiolek Arion Bios do zamrażarki, nawet jeśli ogólne poradniki laboratoryjne przewidują mrożenie. Przy zachowaniu tych warunków produkt jest stabilny przez okres podany na opakowaniu. Certyfikat analizy swojej partii znajdziesz na stronie certyfikatów analizy na podstawie daty produkcji wydrukowanej na opakowaniu.
Łańcuch chłodniczy podczas transportu
Łańcuch chłodniczy oznacza, że produkt pozostaje w zalecanym zakresie temperatur przez całą drogę: w magazynie, w transporcie i po dostawie. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) w wytycznych dotyczących przechowywania i transportu produktów wrażliwych na temperaturę definiuje temperaturę przechowywania jako zakres podany na etykiecie. Odchylenie temperatury (ekskursja) występuje wtedy, gdy produkt jest narażony na temperaturę spoza tego zakresu. To, jakie odchylenie jest jeszcze dopuszczalne, określa producent na podstawie danych o stabilności.
Krótkie odchylenie ma inną wagę dla liofilizatu, a inną dla roztworu. Sigma-Aldrich podaje, że liofilizowane peptydy wysyła się w temperaturze otoczenia i pozostają stabilne od kilku dni do kilku tygodni. Thermo Fisher natomiast dostarcza swoje roztwory peptydów na lodzie i zaleca, by po odbiorze od razu je zamrozić. Roztwór jest po prostu bardziej wrażliwy na temperaturę. Ale także proszek po dostawie powinien trafić do warunków określonych na jego etykiecie.
Jak to robimy: przechowujemy produkty w chłodzie, wysyłamy zamówienia w ciągu 24 godzin w dni robocze i pakujemy je w opakowanie termoizolacyjne z wkładami chłodzącymi. Czas dostawy dla poszczególnych krajów znajdziesz na stronie Dostawa i płatność, a więcej praktycznych informacji w naszym poradniku. Po dostawie zalecamy:
- Odbierz przesyłkę jak najszybciej, zwłaszcza jeśli czeka w punkcie odbioru.
- Od razu ją rozpakuj i włóż produkty do lodówki (2–8 °C).
- Zostaw je w oryginalnym, zamkniętym opakowaniu i nie wkładaj ich do zamrażarki ani do zamrażalnika.
- Jeśli masz wątpliwości co do stanu przesyłki, skontaktuj się z nami i podaj datę produkcji z opakowania.
Światło, opakowanie i oznaki możliwego problemu
Światło może zapoczątkować utlenianie, zwłaszcza w peptydach z aminokwasami aromatycznymi. Dla produktów wrażliwych na światło wytyczne EMA przewidują zapis o przechowywaniu w oryginalnym opakowaniu lub w opakowaniu zewnętrznym. Pudełko nie jest więc tylko opakowaniem transportowym. Chroni zawartość przed światłem, dlatego trzymaj w nim pióra i fiolki aż do użycia w laboratorium.
Podczas zwykłej kontroli wzrokowej zwróć uwagę na takie zmiany:
- Roztwór: zmętnienie, kłaczki, widoczne cząstki lub zmiana barwy. Mogą one wiązać się z agregacją, wytrąceniem osadu lub zmianą chemiczną.
- Liofilizat: skurczony lub zapadnięty placek, lepka albo upłynniona masa, krople na ściance fiolki. Sam wygląd placka nie przesądza jednak o jakości. Niektóre odchylenia powstają już podczas produkcji i nie wpływają na jakość. Zawilgocony proszek to natomiast powód do ostrożności, bo wilgoć obniża stabilność.
Wielu zmian chemicznych, takich jak deamidacja czy utlenianie, nie widać gołym okiem. Wykrywa je dopiero metoda analityczna, na przykład HPLC. Jeśli nie masz pewności co do stanu materiału, nie używaj go do eksperymentu i skontaktuj się z dostawcą.
Szybkie zestawienie
Przechowywanie peptydów w skrócie: ogólne zalecenia dostawców peptydów laboratoryjnych. Liczby odsyłają do listy źródeł na końcu artykułu.
| Postać | Sytuacja | Typowe ogólne zalecenie | Źródło |
|---|---|---|---|
| Liofilizat | Przechowywanie długoterminowe | Zamrażarka, −20 °C lub niżej (podaje się też −80 °C lub poniżej −15 °C) | 3, 5, 6 |
| Liofilizat | Przechowywanie krótkoterminowe | Lodówka, około 4 °C | 3, 5 |
| Liofilizat | Transport | Temperaturę otoczenia znosi zwykle od kilku dni do kilku tygodni | 4 |
| Liofilizat | Otwieranie | Zamkniętą fiolkę najpierw doprowadzić do temperatury pokojowej | 3, 5, 6, 7 |
| Roztwór | Krótkotrwałe przechowywanie | Lodówka, rzędu kilku dni, zwykle najwyżej około tygodnia | 3, 7 |
| Roztwór | Dłuższe przechowywanie w laboratorium | Jednorazowe alikwoty, bez wielokrotnego zamrażania i rozmrażania | 3, 5, 6, 7 |
| Roztwór | Postępowanie | Chronić przed światłem, pracować sterylnie | 6, 7 |
| Produkty Arion Bios (pióra i fiolki) | Zawsze | 2–8 °C, chronić przed światłem, nie zamrażać, w oryginalnym zamkniętym opakowaniu. Kieruj się etykietą. | Instrukcja produktu |
Najczęściej zadawane pytania
Jak długo peptyd wytrzymuje w lodówce?
To zależy od konkretnego peptydu, jego postaci i opakowania. W przypadku produktów Arion Bios obowiązuje okres trwałości podany na opakowaniu, o ile produkt jest przechowywany zgodnie z etykietą w 2–8 °C. Ogólna literatura dotycząca peptydów laboratoryjnych podaje, że liofilizat można krótkoterminowo trzymać w lodówce (Bachem), a zwykłe roztwory peptydów wytrzymują w 4 °C zazwyczaj najwyżej około tygodnia (Sigma-Aldrich). Te orientacyjne wartości nie dotyczą gotowych produktów z własnymi danymi o stabilności.
Czy mogę zamrozić peptyd, żeby dłużej wytrzymał?
W laboratoriach liofilizowane peptydy na zamówienie i alikwoty roztworów zwykle przechowuje się zamrożone. Produktów Arion Bios jednak nie zamrażaj. Ich instrukcja przewiduje 2–8 °C, a etykieta ma pierwszeństwo przed ogólnymi zaleceniami.
Czy to problem, jeśli przesyłka była kilka godzin poza lodówką?
Wysyłamy w opakowaniu termoizolacyjnym z wkładami chłodzącymi, które chroni zawartość przed wahaniami temperatury w transporcie. Według WHO o tym, czy odchylenie jest dopuszczalne, decyduje producent na podstawie danych o stabilności. Liofilizat jest zwykle mniej wrażliwy na krótkie odchylenia niż roztwór. Ważne jest, by włożyć przesyłkę do lodówki od razu po odbiorze. Jeśli była poza chłodem wyraźnie dłużej, skontaktuj się z nami.
Czy po wyglądzie poznam, że peptyd jest uszkodzony?
Tylko częściowo. Zmętnienie, cząstki lub zmiana barwy roztworu to sygnały ostrzegawcze. Wielu zmian chemicznych nie widać jednak gołym okiem i wykrywa je dopiero analiza. I odwrotnie: nie każde odchylenie w wyglądzie liofilizatu oznacza gorszą jakość.
Podsumowanie
Ciepło, wilgoć i światło przyspieszają rozkład peptydów. Liofilizowany proszek jest na ogół stabilniejszy niż roztwór i lepiej znosi krótkie odchylenie temperatury. Roztwory, także w napełnionych piórach, wymagają stałego chłodzenia i ochrony przed światłem. W przypadku produktów Arion Bios zawsze decyduje jednak etykieta: 2–8 °C, chronić przed światłem, nie zamrażać, oryginalne zamknięte opakowanie.
Źródła
- Nugrahadi PP, Hinrichs WLJ, Frijlink HW, Schöneich C, Avanti C. „Designing Formulation Strategies for Enhanced Stability of Therapeutic Peptides in Aqueous Solutions: A Review”. Pharmaceutics, 2023;15(3):935. DOI: 10.3390/pharmaceutics15030935
- Manning MC, Chou DK, Murphy BM, Payne RW, Katayama DS. „Stability of Protein Pharmaceuticals: An Update”. Pharmaceutical Research, 2010;27(4):544–575. DOI: 10.1007/s11095-009-0045-6
- Sigma-Aldrich (Merck). „Handling and Storage Guidelines for Peptides and Proteins”. Artykuł techniczny: sigmaaldrich.com
- Sigma-Aldrich (Merck). „Synthetic Peptide Handling & Storage Protocol”. Protokół laboratoryjny: sigmaaldrich.com
- Bachem. „Handling and Storage Guidelines for Peptides”. Knowledge Center: bachem.com
- GenScript. „Peptide Storage and Handling Guidelines”: genscript.com
- Thermo Fisher Scientific. „Important Information on your HeavyPeptides” (instrukcja postępowania i przechowywania peptydów AQUA): thermofisher.com
- Wang W. „Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals”. International Journal of Pharmaceutics, 2000;203(1–2):1–60. DOI: 10.1016/S0378-5173(00)00423-3
- Światowa Organizacja Zdrowia (WHO). „Model guidance for the storage and transport of time- and temperature-sensitive pharmaceutical products”. WHO Technical Report Series nr 961, aneks 9, 2011: who.int
- Europejska Agencja Leków (EMA). „Guideline on Declaration of Storage Conditions”. CPMP/QWP/609/96/Rev 2, 2007: ema.europa.eu
- Patel SM, Nail SL, Pikal MJ, Geidobler R, Winter G, Hawe A, Davagnino J, Rambhatla Gupta S. „Lyophilized Drug Product Cake Appearance: What Is Acceptable?”. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2017;106(7):1706–1721. DOI: 10.1016/j.xphs.2017.03.014