En el laboratorio, un péptido liofilizado debe disolverse antes de poder trabajar con él. Para ello se mencionan sobre todo dos líquidos: el agua bacteriostática y el agua estéril. A primera vista no se diferencian, ambas son transparentes y estériles. La diferencia está en un único ingrediente añadido. Sin embargo, ese ingrediente determina cuánto tiempo puede usarse un vial abierto y para qué experimentos es adecuado el líquido.
Qué es el agua bacteriostática
La Farmacopea de los Estados Unidos (USP) define el agua bacteriostática (Bacteriostatic Water for Injection) como agua estéril de calidad farmacopea que contiene uno o varios agentes antimicrobianos adecuados. El conservante suele ser el alcohol bencílico. La ficha técnica del fabricante Hospira, por ejemplo, describe agua estéril y apirógena con un 0,9 % de alcohol bencílico (9 mg/ml), o un 1,1 % en una de sus presentaciones. Según la misma ficha, el pH es de aproximadamente 5,7 (intervalo de 4,5 a 7,0).
Según la ficha técnica oficial, el agua bacteriostática está destinada únicamente a diluir o disolver otros preparados. Es, por tanto, un diluyente (en inglés diluent) y no un producto independiente. La farmacopea advierte además expresamente que hay que tener en cuenta la compatibilidad del conservante con la sustancia que se disuelve. Volveremos sobre ello.
La palabra «bacteriostático» significa que una sustancia frena el crecimiento y la multiplicación de las bacterias. No significa que las mate de forma fiable. Las sustancias que matan bacterias se denominan bactericidas. Sobre los viales multidosis, los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de EE. UU. (CDC) señalan que el conservante ayuda a limitar el crecimiento bacteriano, pero no actúa sobre los virus y no protege por completo frente a la contaminación. Por eso, el agua bacteriostática no sustituye al trabajo aséptico.
Qué es el agua estéril
La Farmacopea Europea describe en la monografía Agua para preparaciones inyectables (0169) dos formas de esta agua. El agua «a granel» sirve de vehículo en la fabricación de medicamentos. El agua esterilizada (agua para preparaciones inyectables esterilizada) está destinada a disolver o diluir otros preparados. Así lo resume también la directriz de la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) sobre la calidad del agua para uso farmacéutico. La farmacopea estadounidense recoge un producto equivalente con el nombre de Sterile Water for Injection.
Lo esencial es lo que el agua estéril no contiene. La ficha técnica de Hospira indica que no contiene ningún bacteriostático, ningún agente antimicrobiano ni tampón añadido, y que se suministra solo en envases unidosis. La indicación del fabricante es clara: no reutilizar los envases unidosis y desechar la porción no utilizada.
El motivo es sencillo. En cuanto un vial se abre o se perfora, pueden entrar microorganismos. Sin conservante, nada frena su crecimiento. El agua estéril es, por tanto, «más pura» en el sentido de que no contiene nada más que agua. Pero, una vez abierta, se trata como un producto de un solo uso.
Por qué un conservante: los envases multidosis
El agua bacteriostática se suministra en envases multidosis de los que, según la ficha técnica, pueden hacerse extracciones repetidas. Precisamente por eso contiene un conservante. La farmacopea estadounidense prescribe para ella envases de vidrio de 30 ml como máximo.
Aun así, un conservante no significa un uso ilimitado tras la apertura. En los centros sanitarios y las farmacias de EE. UU., los envases multidosis se rigen por la recomendación del capítulo USP <797>, que también resumen los CDC: tras la primera apertura (por ejemplo, la perforación del tapón), el vial se marca con la fecha y se desecha en un plazo máximo de 28 días, salvo que el fabricante indique otro plazo, más corto o más largo, para el vial abierto. Según los CDC, los viales unidosis no suelen contener conservante.
Lo mencionamos como ejemplo de práctica general para envases multidosis, no como una instrucción. En el laboratorio prevalecen siempre los datos del fabricante en la etiqueta del producto concreto y los procedimientos internos (SOP) de su laboratorio.
Cuándo puede ser un problema el alcohol bencílico en el laboratorio
El alcohol bencílico no es un aditivo inerte. En algunas situaciones puede influir en la sustancia disuelta o en el resultado de un experimento.
Proteínas y agregación. Los conservantes de las formulaciones proteicas multidosis son conocidos por poder favorecer la agregación de las proteínas. Un estudio de 2014 comparó cuatro conservantes habituales con el interferón alfa-2a. Todos provocaron agregación, y el alcohol bencílico quedó en tercer lugar, por detrás del m-cresol y el fenol. Otro trabajo estudió una proteína liofilizada (el antagonista del receptor de la interleucina-1), que los investigadores reconstituyeron en agua o en una solución con un 0,9 % de alcohol bencílico. Con alcohol bencílico se formaron más agregados. Su cantidad dependía de lo bien que la proteína hubiera conservado su estructura durante la liofilización.
Estos estudios se refieren a proteínas, no a péptidos cortos, y sus resultados no pueden trasladarse sin más. El comportamiento de cada sustancia depende de su secuencia. Por tanto, no puede suponerse que el alcohol bencílico sea compatible con cualquier sustancia.
Cultivos celulares y ensayos sensibles. El alcohol bencílico actúa sobre las membranas celulares. En experimentos con células endoteliales en cultivo, aumentó la fluidez de la membrana de forma dependiente de la dosis y, a 50 mmol/l, incrementó de forma significativa la permeabilidad de la capa celular. Como comparación, un 0,9 % de alcohol bencílico equivale a unos 83 mmol/l. Tras la dilución en el medio de cultivo, la concentración es, lógicamente, menor. Aun así, en ensayos celulares sensibles conviene valorar un disolvente sin conservante o, al menos, incluir un control solo con el disolvente.
Solubilidad. No todos los péptidos se disuelven bien en agua, con o sin conservante. Proveedores de péptidos como GenScript y Bachem describen en sus guías un procedimiento general:
- probar primero la solubilidad con una pequeña cantidad de la sustancia,
- en los péptidos cortos, probar primero con agua estéril,
- disolver los péptidos básicos (carga global positiva) en una pequeña cantidad de ácido acético diluido y después diluir,
- disolver los péptidos ácidos (carga global negativa) en una pequeña cantidad de amoníaco diluido; GenScript lo desaconseja en péptidos que contienen cisteína,
- disolver los péptidos hidrófobos y neutros en una pequeña cantidad de un disolvente orgánico, normalmente DMSO, y solo después diluir con agua o tampón.
Bachem advierte además que las concentraciones elevadas de disolventes orgánicos no son compatibles con sistemas biológicos como las células. Según Bachem, no existe un protocolo universal para todos los péptidos. La elección del disolvente depende, por tanto, del protocolo experimental y de los datos de solubilidad, cuando el proveedor los indica en una ficha técnica o en un certificado de análisis.
Disolver un péptido liofilizado: principios generales
Los siguientes puntos describen la práctica general de laboratorio. Las cantidades y concentraciones las fija siempre el protocolo del experimento concreto.
- Deje que el vial alcance la temperatura ambiente. Los péptidos suelen ser higroscópicos. Por eso, Bachem recomienda dejar que el recipiente cerrado alcance la temperatura ambiente, idealmente en un desecador, antes de abrirlo. La humedad absorbida reduce el contenido de péptido y puede disminuir su estabilidad.
- Trabaje de forma aséptica. Limpie los tapones del vial de péptido y del vial de disolvente con una toallita con alcohol y deje que se sequen. Utilice material estéril de un solo uso.
- Añada el disolvente lentamente por la pared interior del vial, no en chorro directo sobre el liofilizado.
- Gire suavemente, no agite. El estrés mecánico, como una agitación enérgica, figura entre los factores descritos que pueden inducir la agregación de proteínas. Si parte de la sustancia no se disuelve, Bachem menciona unos minutos en un baño de ultrasonidos.
- Compruebe el aspecto. La solución debe ser transparente, sin turbidez ni partículas visibles. La turbidez puede indicar una disolución incompleta o agregación. En ese caso, es mejor volver a los datos de solubilidad del proveedor que continuar.
- Etiquete el vial con el nombre de la sustancia, el disolvente utilizado y la fecha de preparación.
Conservación del agua bacteriostática abierta y de las soluciones preparadas
Agua bacteriostática. La ficha técnica de Hospira indica una conservación entre 20 y 25 °C. El agua bacteriostática de nuestra oferta se conserva a temperatura ambiente y protegida de la luz. Siempre prevalecen los datos de la etiqueta del producto concreto. Tras la primera apertura, conviene anotar la fecha en el vial.
La ficha técnica indica expresamente que debe trabajarse de forma aséptica en cada entrada y extracción, única o repetida. En la práctica, esto significa limpiar el tapón con una toallita con alcohol antes de cada extracción y dejar que se seque, usar material estéril nuevo y no devolver nunca nada al vial. Como norma general, un contenido turbio o con partículas visibles no se utiliza.
Soluciones de péptidos preparadas. Bachem recomienda no conservar los péptidos en solución a largo plazo, ni siquiera en solución estéril. Cuando no se pueda evitar, aconseja dividir la solución en porciones más pequeñas (alícuotas). Según Bachem, los péptidos que contienen asparagina, glutamina, metionina, cisteína o triptófano tienen una vida útil más corta. Las condiciones concretas de conservación las fija siempre el proveedor de la sustancia. Para los productos Arion Bios se aplican las indicaciones que acompañan al producto: conservar entre 2 y 8 °C, proteger de la luz, no congelar y mantener en el envase original cerrado.
Comparativa: agua bacteriostática vs. agua estéril
| Característica | Agua bacteriostática | Agua estéril |
|---|---|---|
| Composición | Agua estéril de calidad farmacopea con conservante, normalmente un 0,9 % de alcohol bencílico | Agua estéril de calidad farmacopea sin sustancias añadidas |
| Conservante | Sí – frena el crecimiento bacteriano, no mata las bacterias de forma fiable, no actúa sobre los virus | No |
| Envase | Multidosis, permite extracciones repetidas | Unidosis |
| Tras la apertura | Extracciones repetidas en condiciones asépticas; el plazo lo fija el fabricante (práctica general en envases multidosis: 28 días, salvo que el fabricante indique otra cosa) | La porción no utilizada se desecha |
| Uso típico en el laboratorio | Disolución de sustancias compatibles con el alcohol bencílico, cuando se extrae disolvente varias veces del mismo vial | Experimentos en los que un conservante interferiría (cultivos celulares y ensayos sensibles, sustancias propensas a la agregación) y preparación puntual de una solución |
| Limitaciones | El alcohol bencílico puede favorecer la agregación de proteínas, actúa sobre las membranas celulares y puede afectar a algunos ensayos | Ninguna protección frente al crecimiento microbiano tras la apertura |
El agua bacteriostática en Arion Peptides
Ofrecemos agua bacteriostática como accesorio de laboratorio para péptidos de investigación liofilizados: agua bacteriostática. Como todos nuestros productos, está destinada exclusivamente a uso de laboratorio e investigación. Los certificados de análisis de los lotes de péptidos Arion Bios están disponibles en la página de certificados de análisis.
Preguntas frecuentes
¿El agua bacteriostática es lo mismo que el agua estéril?
No. La base es la misma: agua estéril de calidad farmacopea. El agua bacteriostática contiene además un conservante, normalmente un 0,9 % de alcohol bencílico, y se suministra en envase multidosis. El agua estéril no contiene aditivos y, una vez abierta, está destinada a un solo uso.
¿El agua bacteriostática mata las bacterias?
No de forma fiable. El conservante frena el crecimiento y la multiplicación de las bacterias, pero no es un desinfectante. Según los CDC, no actúa sobre los virus y no protege por completo frente a la contaminación. Por eso, el trabajo aséptico sigue siendo necesario.
¿Cuánto tiempo puede usarse un vial abierto de agua bacteriostática?
Lo decisivo son los datos del fabricante en la etiqueta. En el ámbito sanitario, para los envases multidosis se aplica en general un plazo de 28 días desde la primera apertura según la USP <797>, salvo que el fabricante indique otra cosa. El agua estéril sin conservante es unidosis, y el resto se desecha tras la apertura.
¿Cuándo es mejor elegir agua estéril u otro disolvente?
Cuando el alcohol bencílico podría influir en el resultado, por ejemplo en cultivos celulares y ensayos sensibles o con sustancias propensas a la agregación. La propia solubilidad de la sustancia también puede exigir otro disolvente, como ácido acético diluido para los péptidos básicos o DMSO para los hidrófobos. Lo decisivo es el protocolo experimental y los datos del proveedor.
Fuentes
- Hospira, Inc. (Pfizer), «Bacteriostatic Water for Injection, USP», ficha técnica (prescribing information): labeling.pfizer.com
- Hospira, Inc. (Pfizer), «Sterile Water for Injection, USP», ficha técnica (prescribing information): labeling.pfizer.com
- United States Pharmacopeia, «Bacteriostatic Water for Injection», monografía, USP 38–NF 33, 2015: drugfuture.com
- Agencia Europea de Medicamentos (EMA), «Guideline on the quality of water for pharmaceutical use», EMA/CHMP/CVMP/QWP/496873/2018, 2020 (con referencia a la monografía Ph. Eur. 0169 Agua para preparaciones inyectables): ema.europa.eu
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC), «Preventing Unsafe Injection Practices», resumen de las recomendaciones de la USP <797> para viales multidosis y unidosis: cdc.gov
- Bis RL, Mallela KMG, «Antimicrobial preservatives induce aggregation of interferon alpha-2a: the order in which preservatives induce protein aggregation is independent of the protein», International Journal of Pharmaceutics, 2014;472:356–361. DOI: 10.1016/j.ijpharm.2014.06.044
- Roy S, Jung R, Kerwin BA, Randolph TW, Carpenter JF, «Effects of benzyl alcohol on aggregation of recombinant human interleukin-1-receptor antagonist in reconstituted lyophilized formulations», Journal of Pharmaceutical Sciences, 2005;94(2):382–396. DOI: 10.1002/jps.20258
- Mahler HC, Friess W, Grauschopf U, Kiese S, «Protein aggregation: pathways, induction factors and analysis», Journal of Pharmaceutical Sciences, 2009;98(9):2909–2934. DOI: 10.1002/jps.21566
- Alvarado A, Butterfield DA, Hennig B, «Disruption of endothelial barrier function: relationship to fluidity of membrane extracellular lamella», International Journal of Biochemistry, 1994;26(4):575–581. DOI: 10.1016/0020-711x(94)90016-7
- GenScript, «Peptide Solubility Guidelines», guía técnica: genscript.com
- Bachem, «Handling and Storage Guidelines for Peptides», Knowledge Center: bachem.com