Certificado de análisis de péptidos: cómo leer un CoA

Un polvo liofilizado blanco siempre tiene el mismo aspecto. Tanto si es un péptido puro como una mezcla con subproductos de la síntesis o una molécula completamente distinta, a simple vista no se nota la diferencia. Solo los ensayos de laboratorio muestran lo que contiene realmente el vial. En esta guía repasamos un certificado de análisis paso a paso.

Qué es un certificado de análisis y por qué importa

Un certificado de análisis (en inglés certificate of analysis, abreviado CoA) es un informe con los resultados de los ensayos de un lote concreto de una sustancia. Indica qué métodos se utilizaron, qué se midió y si los resultados cumplieron unos límites fijados de antemano.

Para la investigación esto tiene una importancia práctica. Los péptidos sintéticos se fabrican por lotes y en la síntesis se forman subproductos: péptidos a los que les falta o les sobra un aminoácido, formas oxidadas, restos de grupos protectores o contraiones no deseados. Una revisión publicada en el Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis advierte de que estas impurezas pueden distorsionar los resultados de estudios de laboratorio tempranos y llevar a conclusiones erróneas. Si se quiere que un experimento sea reproducible, hay que saber con qué sustancia y con qué calidad se ha trabajado.

Qué debe contener un certificado de análisis correcto

El formato varía según el fabricante y el laboratorio. Aun así, un certificado fiable debería incluir como mínimo los siguientes datos:

• el nombre de la sustancia, idealmente con su secuencia o fórmula molecular,
• el número de lote (batch, lot) o la fecha de fabricación, que permite asignar el certificado a un envase concreto,
• la fecha del análisis,
• el nombre del laboratorio que realizó los ensayos,
• los métodos utilizados, por ejemplo RP-HPLC con detección UV y espectrometría de masas,
• los resultados junto con los criterios de aceptación, es decir, qué se midió y qué límite debía cumplir la muestra (por ejemplo, «pureza ≥ 98 %»),
• una firma u otra forma de verificación, como el nombre de la persona responsable o un código de verificación.

Una gran ventaja son los datos brutos adjuntos, es decir, el cromatograma y el espectro de masas. Una cifra sin gráfico es mucho más difícil de comprobar.

El proyecto de directriz de la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) sobre péptidos sintéticos contempla una lista aún más amplia para principios activos: además de la identidad y la pureza, el contenido de péptido, los contraiones, el agua, las endotoxinas y la pureza microbiológica. El certificado de una sustancia de investigación no tiene por qué cubrirlo todo, pero la lista muestra qué preguntar.

Pureza por HPLC: qué significa el «porcentaje de área»

El dato más habitual en un certificado es la pureza determinada por cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), normalmente en fase inversa (RP-HPLC). La muestra pasa por una columna que separa sus componentes y un detector a la salida mide la absorción de luz ultravioleta (UV). El resultado es un cromatograma: una curva con picos, en la que cada pico corresponde a una o varias sustancias.

En los péptidos, la detección UV suele ajustarse a una longitud de onda de unos 214 nm. A esa longitud de onda absorbe con fuerza el enlace peptídico, el enlace entre aminoácidos que tiene todo péptido. Así, el detector registra el péptido principal y la mayoría de las impurezas peptídicas.

La pureza se calcula como porcentaje de área (area %): el área del pico del péptido buscado dividida por la suma de las áreas de todos los picos registrados. Una pureza del 98,5 % significa, por tanto, que el pico principal supone el 98,5 % del área total de picos a esa longitud de onda.

Es una cifra útil, pero tiene sus límites. La pureza por HPLC:

• no demuestra la identidad. Solo indica que un componente predomina en la muestra, no que sea la molécula correcta.
• puede no detectar impurezas con el mismo tiempo de retención que el pico principal. Una nota de aplicación de Thermo Fisher Scientific señala expresamente que estas impurezas que coeluyen no pueden descartarse solo con la señal UV.
• no es un balance de masas exacto. No todos los péptidos tienen la misma respuesta UV, de modo que el área de un pico no siempre se corresponde exactamente con la masa.
• no dice nada sobre la cantidad. La pureza expresa la proporción del péptido buscado entre los componentes peptídicos. El agua y las sales no se incluyen.

Espectrometría de masas: ¿es realmente la molécula correcta?

La identidad, es decir, que el vial contiene el péptido declarado, la confirma la espectrometría de masas (MS). En péptidos se suele utilizar la ionización por electrospray (ESI-MS), a menudo acoplada directamente a la cromatografía (LC-MS). El equipo no pesa las moléculas directamente. Mide la relación entre masa y carga, que se escribe m/z.

Durante la ionización, un péptido capta uno o varios protones. Por eso una misma molécula puede aparecer en el espectro como varios picos: con una carga ([M+H]⁺), con dos ([M+2H]²⁺), etc. A partir de cada pico se puede recalcular la masa de la molécula: M = z × (m/z − 1,007), donde z es el número de cargas y 1,007 la masa de un protón.

Ejemplo: según PubChem, el BPC-157 tiene la fórmula C₆₂H₉₈N₁₆O₂₂ y una masa molecular de 1419,5 g/mol. En el espectro deberían aparecer aproximadamente estos valores (calculados a partir de la masa media y redondeados):

En el caso del MOTS-c, con una masa molecular de 2174,6 g/mol, el ion con doble carga estaría en torno a m/z 1088,3 y el de triple carga en torno a 725,9.

El certificado debería indicar la masa teórica y la masa medida, y ambas deberían coincidir. Un artículo sobre el control de péptidos sintéticos publicado en Pharmaceutical Technology menciona como ejemplo el requisito de que la masa monoisotópica medida no se aleje más de ±1,0 unidades de masa del valor teórico. Atención a los dos tipos de masa: la masa media (1419,5 en el BPC-157) incluye la distribución natural de isótopos, mientras que la monoisotópica (unos 1418,7) solo considera los isótopos más ligeros. Los equipos de menor resolución suelen dar la masa media; los de alta resolución, la monoisotópica.

Sin embargo, la masa por sí sola no lo revela todo. Un péptido con los mismos aminoácidos en otro orden tiene la misma masa. Por eso, para confirmar la secuencia se utiliza la fragmentación (MS/MS), y el proyecto de directriz de la EMA recomienda al menos dos métodos independientes (ortogonales) para identificar un péptido, por ejemplo LC-MS y análisis de aminoácidos.

Pureza no es contenido: cuánto péptido hay en el vial

Aquí surge el malentendido más frecuente. La pureza indica qué proporción del material peptídico corresponde al péptido buscado. El contenido de péptido (en inglés net peptide content) indica qué proporción del peso total del polvo es material peptídico. El resto son contraiones y agua residual.

Los contraiones entran en el péptido durante la fabricación. El ácido trifluoroacético (TFA) se usa para escindir el péptido terminado en la síntesis en fase sólida y también como aditivo en la purificación por HPLC. Tras la liofilización, el péptido queda en forma de sal de trifluoroacetato. Un estudio de 2025 midió en los péptidos analizados contenidos de TFA de hasta el 35 % del peso total de la sal. Según la EMA, en los péptidos sintéticos se suele usar acetato como contraión, pero el acetato tampoco es péptido. Además, el polvo liofilizado retiene agua.

Así pues, el peso del polvo se compone de péptido, contraiones y agua. El fabricante de péptidos Bachem pone el ejemplo de un contenido de péptido del 85 %: de 1 mg de polvo, 0,85 mg son material peptídico. Esa proporción incluye además las impurezas peptídicas. Bachem también señala que dos muestras con la misma pureza del 95 % pueden contener cantidades distintas del péptido objetivo si su contenido es diferente (por ejemplo, 80 % frente a 95 %).

Por eso un vial con una pureza del 99 % puede contener menos de 10 mg de péptido aunque en la etiqueta figuren 10 mg. Depende de si la cifra se refiere al peso del polvo o al contenido neto de péptido. Un buen certificado lo indica expresamente o incluye un dato aparte sobre el contenido o la cantidad de péptido.

El contenido de péptido se determina, por ejemplo, mediante:

• análisis de aminoácidos, en el que el péptido se descompone en sus aminoácidos y estos se miden,
• análisis elemental de nitrógeno, ya que ni los contraiones ni el agua contienen nitrógeno,
• HPLC cuantitativa frente a un patrón de referencia de contenido conocido.

El contenido de contraiones se mide, por ejemplo, por cromatografía iónica. El artículo de Pharmaceutical Technology recomienda sumar el contenido de péptido, los contraiones y el agua. El resultado debería acercarse al 100 %.

Otros ensayos del certificado

• Endotoxinas bacterianas. Las endotoxinas son componentes de la pared celular de las bacterias gramnegativas. Se determinan con la prueba LAL (lisado de amebocitos de Limulus, el cangrejo herradura), cuyos procedimientos describe, por ejemplo, la farmacopea estadounidense en el capítulo USP <85>. Ni la HPLC ni la MS detectan endotoxinas, así que una pureza alta no dice nada sobre ellas.
• Esterilidad y pureza microbiológica. Relevantes sobre todo en sustancias en solución. El proyecto de directriz de la EMA incluye la pureza microbiológica entre los ensayos habituales.
• Aspecto. Por ejemplo, «polvo liofilizado blanco» o «solución transparente e incolora». Un control sencillo que revela desviaciones evidentes.
• Solubilidad. En qué disolvente se disuelve la sustancia dando una solución transparente.

Señales de alerta

• Falta el número de lote o la fecha de fabricación. El certificado no puede asignarse a un envase concreto.
• Falta el nombre del laboratorio o la fecha del análisis. No está claro quién hizo los ensayos ni cuándo.
• Todos los lotes tienen el mismo cromatograma o las mismas cifras. Los resultados corresponden a un lote concreto. Bachem indica expresamente que el contenido de péptido es un valor específico de cada lote.
• Falta la prueba de identidad. Una pureza sin espectrometría de masas solo demuestra que una sustancia predomina en la muestra.
• Un resultado irrealmente perfecto, como una pureza de exactamente el 100,0 %. En la síntesis de péptidos se forman habitualmente subproductos, y la Farmacopea Europea fija el umbral de notificación de impurezas relacionadas con el péptido en el 0,1 %. Un resultado sin un solo pico secundario merece preguntas.
• La masa teórica no coincide. Compárela con una base de datos pública como PubChem.
• No se puede verificar nada. Ni cromatograma, ni espectro, ni contacto con el laboratorio, ni código de verificación.

Un ensayo realizado por un laboratorio independiente, sin vínculos con el vendedor, es una prueba más sólida. Algunos de estos laboratorios, por ejemplo Janoshik Analytical en Praga, indican en el informe una clave de verificación con la que se puede consultar el resultado en la web del laboratorio. Así puede comprobar que el documento coincide con el registro del laboratorio y que no se ha modificado posteriormente. Incluso con un ensayo independiente sigue siendo válido todo lo anterior: lote, métodos, identidad y contenido.

Cómo funciona en Arion Peptides

Publicamos los certificados de análisis de los productos Arion Bios en la página Certificados. Para asignar un certificado a un envase concreto, utilice la fecha de fabricación impresa en el embalaje. Al leerlo, puede seguir la misma lista de comprobación que con cualquier otro certificado de análisis.

Preguntas frecuentes

¿Una pureza del 99 % significa que el vial contiene un 99 % de péptido?

No. La pureza por HPLC expresa la proporción del péptido buscado entre los componentes peptídicos. El peso del polvo incluye también contraiones y agua, que no se tienen en cuenta en la pureza. La cantidad real de péptido en la muestra la indica el contenido de péptido.

¿Por qué no basta con la HPLC?

La HPLC muestra qué porcentaje del área de picos corresponde al componente principal, pero no confirma de qué molécula se trata. La identidad la demuestra la espectrometría de masas, que compara la masa medida con la teórica.

¿Cómo sé que el certificado corresponde a mi envase?

Busque en el certificado el número de lote o la fecha de fabricación y compárelos con el dato del embalaje. En los productos Arion Bios, el certificado se asigna por la fecha de fabricación que figura en el embalaje.

¿Por qué resulta sospechosa una pureza del 100,0 %?

En la síntesis de péptidos se forman habitualmente subproductos, y un método sensible detecta impurezas en torno al 0,1 %. Un resultado de exactamente el 100,0 % exige, por tanto, una explicación sobre el método y la sensibilidad con que se obtuvo.

Fuentes

1. European Medicines Agency, «Guideline on the Development and Manufacture of Synthetic Peptides» (borrador para consulta pública), EMA/CHMP/CVMP/QWP/387541/2023, 2023: ema.europa.eu
2. Swietlow A, Verlander M, Gregg B, Rode H, Eggen I, Szajek A, «Control Strategies for Synthetic Therapeutic Peptide APIs – Part I: Analytical Consideration», Pharmaceutical Technology, 2014: pharmtech.com
3. Grosse S, Samonig M, De Pra M, Steiner F, «Impurity profiling of the synthetic peptide LL-37 using high-performance liquid chromatography with combined UV and single quadrupole mass spectrometric detection», Thermo Fisher Scientific, nota de aplicación 72818, 2018: thermofisher.com
4. D'Hondt M, Bracke N, Taevernier L, Gevaert B, Verbeke F, Wynendaele E, De Spiegeleer B, «Related impurities in peptide medicines», Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2014;101:2–30. DOI: 10.1016/j.jpba.2014.06.012
5. Erckes V, Streuli A, Chamera Rendueles L, Krämer SD, Steuer C, «Towards a Consensus for the Analysis and Exchange of TFA as a Counterion in Synthetic Peptides and Its Influence on Membrane Permeation», Pharmaceuticals, 2025;18(8):1163. DOI: 10.3390/ph18081163
6. Bachem, «What does net peptide content mean?», preguntas frecuentes técnicas: bachem.com
7. Bachem, «Peptide Calculator» (pureza y contenido de péptido), Knowledge Center: bachem.com
8. U.S. Food and Drug Administration, «Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers (Edition 2)», Guidance for Industry, 2026: fda.gov
9. National Center for Biotechnology Information, «PubChem Compound Summary: BPC-157 (CID 9941957) y MOTS-c (CID 146675088)»: pubchem.ncbi.nlm.nih.gov, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov