Lyofilizovaný (zmrazeně sušený) peptid je v laboratoři potřeba před prací rozpustit. Nejčastěji se přitom mluví o dvou kapalinách: o bakteriostatické vodě a o sterilní vodě. Na první pohled se neliší, obě jsou čiré a sterilní. Rozdíl je v jediné přísadě. Ta ale rozhoduje o tom, jak dlouho lze otevřenou lahvičku používat a pro které pokusy se kapalina hodí.
Co je bakteriostatická voda
Americký lékopis (USP) definuje bakteriostatickou vodu (Bacteriostatic Water for Injection) jako sterilní vodu lékopisné kvality, která obsahuje jednu nebo více vhodných antimikrobních látek. Konzervační látkou bývá benzylalkohol. Například příbalový text výrobce Hospira uvádí sterilní, apyrogenní vodu s 0,9 % benzylalkoholu (9 mg/ml), u jednoho z balení 1,1 %. Hodnota pH je podle stejného textu přibližně 5,7 (rozmezí 4,5–7,0).
Podle oficiálního příbalového textu je bakteriostatická voda určena výhradně k ředění nebo rozpouštění jiných přípravků. Je to tedy rozpouštědlo (anglicky diluent), ne samostatný přípravek. Lékopis navíc výslovně upozorňuje, že je třeba brát ohled na slučitelnost konzervační látky s rozpouštěnou látkou. K tomu se ještě vrátíme.
Slovo „bakteriostatický“ znamená, že látka brzdí růst a množení bakterií. Neznamená, že je spolehlivě zabíjí. Látky, které bakterie zabíjejí, se označují jako baktericidní. Americké Centrum pro kontrolu a prevenci nemocí (CDC) k vícedávkovým lahvičkám uvádí, že konzervační látka pomáhá omezit růst bakterií, ale na viry nepůsobí a před kontaminací nechrání úplně. Bakteriostatická voda proto nenahrazuje aseptickou práci.
Co je sterilní voda
Evropský lékopis popisuje v monografii Water for injections (0169) dvě podoby této vody. Voda „in bulk“ slouží jako vehikulum při výrobě léčiv. Sterilizovaná voda (sterilised water for injections) je určena k rozpouštění nebo ředění jiných přípravků. Shrnuje to i pokyn Evropské agentury pro léčivé přípravky (EMA) o kvalitě vody pro farmaceutické použití. Americký lékopis má obdobný přípravek pod názvem Sterile Water for Injection.
Podstatné je, co sterilní voda neobsahuje. Příbalový text výrobce Hospira uvádí, že v ní není žádná bakteriostatická ani antimikrobní látka ani přidaný pufr a že se dodává pouze v jednodávkovém balení. Pokyn výrobce je jednoznačný: jednodávkové balení znovu nepoužívat a nespotřebovaný zbytek zlikvidovat.
Důvod je prostý. Jakmile se lahvička otevře nebo propíchne, mohou se do ní dostat mikroorganismy. Bez konzervantu nic nebrzdí jejich růst. Sterilní voda je tedy „čistší“ v tom smyslu, že kromě vody nic neobsahuje. Po otevření se s ní ale zachází jako s jednorázovou.
Proč konzervant: vícedávková balení
Bakteriostatická voda se dodává ve vícedávkovém balení, ze kterého lze podle příbalového textu opakovaně odebírat. Právě kvůli tomu obsahuje konzervant. Americký lékopis pro ni předepisuje skleněné obaly o objemu nejvýše 30 ml.
Ani konzervant ale neznamená neomezenou použitelnost po otevření. Ve zdravotnictví a v lékárnách v USA se u vícedávkových balení uplatňuje doporučení kapitoly USP <797>, které shrnuje i CDC: po prvním otevření (například propíchnutí zátky) se lahvička označí datem a zlikviduje nejpozději do 28 dnů, pokud výrobce pro otevřenou lahvičku neuvádí jinou lhůtu, kratší nebo delší. Jednodávkové lahvičky podle CDC konzervant obvykle neobsahují.
Uvádíme to jako příklad obecné praxe u vícedávkových balení, nikoli jako pokyn. V laboratoři vždy rozhoduje údaj výrobce na etiketě konkrétního přípravku a interní postupy vaší laboratoře (SOP).
Kdy může benzylalkohol v laboratoři vadit
Benzylalkohol není netečná přísada. V některých situacích může ovlivnit rozpouštěnou látku nebo výsledek pokusu.
Proteiny a agregace. Konzervační látky ve vícedávkových přípravcích s bílkovinami jsou známé tím, že mohou podporovat jejich agregaci (shlukování). Studie z roku 2014 porovnávala čtyři běžné konzervanty na interferonu alfa-2a. Všechny agregaci vyvolaly a benzylalkohol skončil v pořadí třetí, za m-kresolem a fenolem. Jiná práce sledovala lyofilizovaný protein (antagonistu receptoru pro interleukin-1), který vědci rozpouštěli buď ve vodě, nebo v roztoku s 0,9 % benzylalkoholu. S benzylalkoholem vznikalo více agregátů. Jejich množství záviselo na tom, jak dobře si protein během lyofilizace zachoval svou strukturu.
Tyto studie se týkají proteinů, ne krátkých peptidů, a jejich výsledky nelze automaticky přenášet. Chování každé látky závisí na její sekvenci. Nelze tedy předpokládat, že je benzylalkohol slučitelný s každou látkou.
Buněčné kultury a citlivé testy. Benzylalkohol působí na buněčné membrány. V pokusech na kultivovaných endotelových buňkách zvyšoval tekutost membrán v závislosti na dávce a při koncentraci 50 mmol/l významně zvýšil propustnost buněčné vrstvy. Pro srovnání: 0,9 % benzylalkoholu odpovídá přibližně 83 mmol/l. Po naředění do kultivačního média je koncentrace samozřejmě nižší. U citlivých buněčných testů se ale vyplatí zvážit rozpouštědlo bez konzervantu, nebo alespoň zařadit kontrolu se samotným rozpouštědlem.
Rozpustnost. Ne každý peptid se dobře rozpustí ve vodě, ať už s konzervantem, nebo bez něj. Dodavatelé peptidů, například GenScript a Bachem, ve svých příručkách uvádějí obecný postup:
- rozpustnost nejdřív vyzkoušet na malém množství látky,
- u krátkých peptidů zkusit nejdřív sterilní vodu,
- zásadité peptidy (s celkově kladným nábojem) rozpustit v malém množství zředěné kyseliny octové a pak ředit,
- kyselé peptidy (s celkově záporným nábojem) v malém množství zředěného amoniaku; u peptidů s cysteinem ho GenScript nedoporučuje,
- hydrofobní a neutrální peptidy v malém množství organického rozpouštědla, typicky DMSO, a teprve potom ředit vodou nebo pufrem.
Bachem zároveň upozorňuje, že vysoké koncentrace organických rozpouštědel nejsou slučitelné s biologickými systémy, například s buňkami. Univerzální postup pro všechny peptidy podle něj neexistuje. Volba rozpouštědla se proto řídí protokolem pokusu a údaji o rozpustnosti, pokud je dodavatel uvádí v technickém listu nebo v certifikátu analýzy.
Rozpouštění lyofilizovaného peptidu: obecné zásady
Následující body popisují obecnou laboratorní praxi. Množství a koncentrace vždy určuje protokol konkrétního pokusu.
- Nechte lahvičku ohřát na pokojovou teplotu. Peptidy bývají hygroskopické. Bachem proto doporučuje nechat uzavřenou nádobku dosáhnout okolní teploty, ideálně v exsikátoru, a teprve pak ji otevřít. Přijatá vlhkost snižuje obsah peptidu a může zhoršit jeho stabilitu.
- Pracujte asepticky. Zátku lahvičky s peptidem i s rozpouštědlem otřete alkoholovým tamponem a nechte zaschnout. Používejte sterilní pomůcky na jedno použití.
- Přidávejte rozpouštědlo pomalu po stěně lahvičky, ne přímým proudem na lyofilizát.
- Jemně kružte, netřepejte. Mechanické namáhání, například prudké třepání, patří mezi popsané faktory, které mohou vyvolat agregaci proteinů. Pokud část látky zůstává nerozpuštěná, Bachem zmiňuje několikaminutové ošetření v ultrazvukové lázni.
- Zkontrolujte vzhled. Roztok má být čirý, bez zákalu a bez viditelných částic. Zákal může znamenat neúplné rozpuštění nebo agregaci. V takovém případě je lepší vrátit se k údajům dodavatele o rozpustnosti než pokračovat.
- Označte lahvičku názvem látky, použitým rozpouštědlem a datem přípravy.
Skladování otevřené bakteriostatické vody a hotových roztoků
Bakteriostatická voda. Příbalový text výrobce Hospira uvádí skladování při 20–25 °C. Bakteriostatická voda v naší nabídce se skladuje při pokojové teplotě a chrání se před světlem. Vždy platí údaje na etiketě konkrétního přípravku. Po prvním otevření je vhodné napsat na lahvičku datum.
Příbalový text výslovně uvádí, že při jednorázovém i opakovaném odběru z lahvičky je třeba pracovat asepticky. V praxi to znamená před každým odběrem otřít zátku alkoholovým tamponem a nechat ji zaschnout, použít novou sterilní pomůcku a nic nevracet zpět do lahvičky. Zakalený obsah nebo obsah s viditelnými částicemi se podle obecné zásady nepoužívá.
Hotové roztoky peptidů. Bachem doporučuje peptidy v roztoku dlouhodobě neuchovávat, a to ani ve sterilním roztoku. Pokud je to nutné, radí rozdělit roztok na menší podíly (alikvoty). Kratší trvanlivost mají podle něj peptidy, které obsahují asparagin, glutamin, methionin, cystein nebo tryptofan. Konkrétní podmínky skladování vždy určuje dodavatel dané látky. U produktů Arion Bios platí pokyny uvedené u produktu: skladovat při 2–8 °C, chránit před světlem, nezmrazovat a uchovávat v původním uzavřeném balení.
Srovnání: bakteriostatická vs. sterilní voda
| Vlastnost | Bakteriostatická voda | Sterilní voda |
|---|---|---|
| Složení | Sterilní voda lékopisné kvality s konzervační látkou, typicky 0,9 % benzylalkoholu | Sterilní voda lékopisné kvality bez přidaných látek |
| Konzervační látka | Ano – brzdí růst bakterií, spolehlivě je nezabíjí, na viry nepůsobí | Ne |
| Balení | Vícedávkové, umožňuje opakovaný odběr | Jednodávkové |
| Po otevření | Opakovaný odběr za aseptických podmínek; lhůtu určuje výrobce (obecná praxe u vícedávkových balení: 28 dnů, pokud výrobce neuvádí jinak) | Nespotřebovaný zbytek se zlikviduje |
| Typické laboratorní využití | Rozpouštění látek, se kterými je benzylalkohol slučitelný, když se z jedné lahvičky rozpouštědla odebírá opakovaně | Pokusy, kde by konzervant vadil (citlivé buněčné kultury a testy, látky náchylné k agregaci), a jednorázová příprava roztoku |
| Omezení | Benzylalkohol může podporovat agregaci proteinů, působí na buněčné membrány a může ovlivnit některé testy | Po otevření žádná ochrana proti růstu mikroorganismů |
Bakteriostatická voda v nabídce Arion Peptides
Bakteriostatickou vodu nabízíme jako laboratorní příslušenství k lyofilizovaným výzkumným peptidům: bakteriostatická voda. Stejně jako ostatní produkty je určena výhradně pro laboratorní a výzkumné účely. Certifikáty analýzy k šaržím peptidů Arion Bios najdete na stránce certifikátů analýzy.
Časté dotazy
Je bakteriostatická voda totéž co sterilní voda?
Ne. Základ je stejný, sterilní voda lékopisné kvality. Bakteriostatická voda navíc obsahuje konzervační látku, obvykle 0,9 % benzylalkoholu, a dodává se ve vícedávkovém balení. Sterilní voda žádné přísady neobsahuje a po otevření je určena k jednorázovému použití.
Zabíjí bakteriostatická voda bakterie?
Spolehlivě ne. Konzervant brzdí růst a množení bakterií, ale není dezinfekcí. Podle CDC nepůsobí na viry a před kontaminací nechrání úplně. Aseptický postup je proto nutný i u ní.
Jak dlouho lze otevřenou lahvičku bakteriostatické vody používat?
Rozhoduje údaj výrobce na etiketě. Ve zdravotnictví se u vícedávkových balení obecně uplatňuje lhůta 28 dnů od prvního otevření podle USP <797>, pokud výrobce neuvádí jinak. Sterilní voda bez konzervantu je jednodávková a její zbytek se po otevření likviduje.
Kdy volit sterilní vodu nebo jiné rozpouštědlo?
Tam, kde by benzylalkohol mohl ovlivnit výsledek, tedy například u citlivých buněčných kultur a testů nebo u látek náchylných k agregaci. Jiné rozpouštědlo může vyžadovat i samotná rozpustnost látky, například zředěnou kyselinu octovou u zásaditých peptidů nebo DMSO u hydrofobních. Rozhodující je protokol pokusu a údaje dodavatele.
Zdroje
- Hospira, Inc. (Pfizer), „Bacteriostatic Water for Injection, USP“, příbalový text (prescribing information): labeling.pfizer.com
- Hospira, Inc. (Pfizer), „Sterile Water for Injection, USP“, příbalový text (prescribing information): labeling.pfizer.com
- United States Pharmacopeia, „Bacteriostatic Water for Injection“, lékopisná monografie, USP 38–NF 33, 2015: drugfuture.com
- European Medicines Agency, „Guideline on the quality of water for pharmaceutical use“, EMA/CHMP/CVMP/QWP/496873/2018, 2020 (s odkazem na monografii Ph. Eur. 0169 Water for injections): ema.europa.eu
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC), „Preventing Unsafe Injection Practices“, shrnutí doporučení USP <797> pro vícedávkové a jednodávkové lahvičky: cdc.gov
- Bis RL, Mallela KMG, „Antimicrobial preservatives induce aggregation of interferon alpha-2a: the order in which preservatives induce protein aggregation is independent of the protein“, International Journal of Pharmaceutics, 2014;472:356–361. DOI: 10.1016/j.ijpharm.2014.06.044
- Roy S, Jung R, Kerwin BA, Randolph TW, Carpenter JF, „Effects of benzyl alcohol on aggregation of recombinant human interleukin-1-receptor antagonist in reconstituted lyophilized formulations“, Journal of Pharmaceutical Sciences, 2005;94(2):382–396. DOI: 10.1002/jps.20258
- Mahler HC, Friess W, Grauschopf U, Kiese S, „Protein aggregation: pathways, induction factors and analysis“, Journal of Pharmaceutical Sciences, 2009;98(9):2909–2934. DOI: 10.1002/jps.21566
- Alvarado A, Butterfield DA, Hennig B, „Disruption of endothelial barrier function: relationship to fluidity of membrane extracellular lamella“, International Journal of Biochemistry, 1994;26(4):575–581. DOI: 10.1016/0020-711x(94)90016-7
- GenScript, „Peptide Solubility Guidelines“, technický list: genscript.com
- Bachem, „Handling and Storage Guidelines for Peptides“, Knowledge Center: bachem.com