Upozornění: Text slouží výhradně k informačním účelům a vychází z publikovaných zdrojů. Produkty Arion Bios jsou určeny výhradně pro laboratorní a výzkumné účely, nejsou léčivem ani doplňkem stravy a nejsou určeny k použití u lidí ani zvířat.

Bílý lyofilizovaný prášek vypadá pořád stejně. Ať jde o čistý peptid, o směs s vedlejšími produkty syntézy, nebo o úplně jinou molekulu, okem rozdíl nepoznáte. O tom, co v lahvičce skutečně je, vypovídají jen laboratorní zkoušky. V tomto návodu projdeme certifikát analýzy krok za krokem.

Co je certifikát analýzy a proč na něm záleží

Certifikát analýzy (anglicky certificate of analysis, zkráceně CoA) je protokol s výsledky zkoušek jedné konkrétní šarže látky. Uvádí, jakými metodami se vzorek zkoušel, co se naměřilo a zda výsledky splnily předem stanovené limity.

Pro výzkum to má praktický význam. Syntetické peptidy se vyrábějí po šaržích a při syntéze vznikají vedlejší produkty: peptidy s chybějící nebo přebývající aminokyselinou, oxidované formy, zbytky chránicích skupin nebo nežádoucí protiionty. Přehledová práce v časopise Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis upozorňuje, že takové nečistoty mohou zkreslit i výsledky raných laboratorních studií a vést k chybným závěrům. Kdo chce, aby jeho pokus šel zopakovat, potřebuje vědět, s jakou látkou a v jaké kvalitě pracoval.

Co má správný certifikát obsahovat

Formát se liší podle výrobce a laboratoře. Důvěryhodný certifikát by ale měl obsahovat alespoň tyto údaje:

  • název látky, ideálně se sekvencí nebo molekulovým vzorcem,
  • číslo šarže (batch, lot) nebo datum výroby, podle kterého certifikát přiřadíte ke konkrétnímu balení,
  • datum analýzy,
  • název laboratoře, která zkoušky provedla,
  • použité metody, například RP-HPLC s UV detekcí a hmotnostní spektrometrii,
  • výsledky spolu s kritérii přijatelnosti, tedy co se naměřilo a jaký limit měl vzorek splnit (například „čistota ≥ 98 %“),
  • podpis nebo jiný způsob ověření, třeba jméno odpovědné osoby nebo ověřovací kód.

Velkou výhodou jsou přiložené surové výstupy, tedy chromatogram a hmotnostní spektrum. Samotné číslo bez grafu se ověřuje mnohem hůř.

Návrh pokynu Evropské agentury pro léčivé přípravky (EMA) k syntetickým peptidům uvádí pro léčivé látky ještě širší seznam: vedle identity a čistoty také obsah peptidu, protiionty, vodu, endotoxiny a mikrobiologickou čistotu. Certifikát výzkumné látky nemusí obsahovat všechno, ale seznam ukazuje, na co se ptát.

Čistota podle HPLC: co znamenají procenta plochy

Nejčastějším údajem na certifikátu je čistota stanovená vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC), obvykle v reverzním uspořádání (RP-HPLC). Vzorek projde kolonou, která jednotlivé složky oddělí, a detektor na výstupu měří absorpci ultrafialového (UV) světla. Výsledkem je chromatogram: křivka s píky, kde každý pík odpovídá jedné nebo více látkám.

U peptidů se UV detekce obvykle nastavuje na vlnovou délku kolem 214 nm. Při ní silně absorbuje peptidová vazba, tedy vazba mezi aminokyselinami, kterou má každý peptid. Detektor tak zachytí hlavní peptid i většinu peptidových nečistot.

Čistota se počítá jako procento plochy (area %): plocha píku hledaného peptidu vydělená součtem ploch všech zaznamenaných píků. Čistota 98,5 % tedy znamená, že hlavní pík tvoří 98,5 % celkové plochy píků při dané vlnové délce.

Je to užitečné číslo, ale má své hranice. Čistota podle HPLC:

  • neprokazuje identitu. Říká jen, že ve vzorku převažuje jedna složka, ne že jde o správnou molekulu.
  • nemusí odhalit nečistoty se stejným retenčním časem jako hlavní pík. Aplikační poznámka Thermo Fisher Scientific výslovně uvádí, že takové souběžně eluující nečistoty nelze na základě samotného UV záznamu vyloučit.
  • není přesná hmotnostní bilance. Různé peptidy nemají stejnou UV odezvu, takže plocha píku vždy přesně neodpovídá hmotnosti.
  • neříká nic o množství. Čistota vyjadřuje podíl hledaného peptidu mezi peptidovými složkami. Voda a soli se do ní nepočítají.

Hmotnostní spektrometrie: je to opravdu ta správná molekula?

Identitu, tedy to, že v lahvičce je deklarovaný peptid, potvrzuje hmotnostní spektrometrie (MS). U peptidů se obvykle používá ionizace elektrosprejem (ESI-MS), často spojená přímo s chromatografií (LC-MS). Přístroj neváží molekuly přímo. Měří poměr hmotnosti a náboje, značený m/z.

Peptid při ionizaci přijme jeden nebo několik protonů. Jedna molekula se proto ve spektru může objevit jako několik píků: s jedním nábojem ([M+H]+), se dvěma ([M+2H]2+) a tak dále. Z každého píku se dá hmotnost molekuly dopočítat podle vztahu M = z × (m/z − 1,007), kde z je počet nábojů a 1,007 je hmotnost protonu.

Příklad: BPC-157 má podle databáze PubChem vzorec C62H98N16O22 a molekulovou hmotnost 1419,5 g/mol. Ve spektru by se tedy měly objevit přibližně tyto hodnoty (vypočteno z průměrné hmotnosti a zaokrouhleno):

IontNáboj (z)Očekávané m/z
[M+H]+1≈ 1420,5
[M+2H]2+2≈ 710,8
[M+3H]3+3≈ 474,2

U MOTS-c s hmotností 2174,6 g/mol by dvakrát nabitý iont ležel kolem m/z 1088,3 a třikrát nabitý kolem 725,9.

Na certifikátu by měla být teoretická i naměřená hmotnost a měly by spolu souhlasit. Odborný článek o kontrole syntetických peptidů v časopise Pharmaceutical Technology uvádí jako příklad požadavek, aby se naměřená monoizotopová hmotnost lišila od teoretické nejvýše o ±1,0 hmotnostní jednotky. Pozor na dva typy hmotnosti: průměrná (u BPC-157 1419,5) zahrnuje přirozené zastoupení izotopů, monoizotopová (asi 1418,7) jen nejlehčí izotopy. Přístroje s nižším rozlišením obvykle uvádějí průměrnou, přístroje s vysokým rozlišením monoizotopovou.

Samotná hmotnost ale neodhalí všechno. Peptid se stejnými aminokyselinami v jiném pořadí má stejnou hmotnost. Proto se k potvrzení sekvence používá fragmentace (MS/MS) a návrh pokynu EMA doporučuje pro identifikaci peptidu alespoň dvě na sobě nezávislé metody, například LC-MS a aminokyselinovou analýzu.

Čistota není obsah: kolik peptidu je v lahvičce

Tady vzniká nejčastější nedorozumění. Čistota říká, jaký podíl peptidového materiálu tvoří hledaný peptid. Obsah peptidu (anglicky net peptide content) říká, jaký podíl celkové hmotnosti prášku tvoří peptidový materiál vůbec. Zbytek připadá na protiionty a zbytkovou vodu.

Protiionty se do peptidu dostávají při výrobě. Kyselina trifluoroctová (TFA) se používá k odštěpení hotového peptidu při syntéze na pevné fázi a také jako přísada při čištění pomocí HPLC. Po lyofilizaci zůstává peptid ve formě soli s trifluoroacetátem. Studie z roku 2025 naměřila u zkoumaných peptidů obsah TFA až 35 % celkové hmotnosti soli. Podle EMA se u syntetických peptidů obvykle používá acetát, ale ani ten není peptid. Lyofilizovaný prášek navíc na sebe váže vodu.

Hmotnost prášku tedy tvoří peptid, protiionty a voda. Výrobce peptidů Bachem uvádí příklad s obsahem peptidu 85 %: z 1 mg prášku připadá na peptidový materiál 0,85 mg. Do tohoto podílu se navíc počítají i peptidové nečistoty. Bachem také upozorňuje, že dva vzorky se stejnou čistotou 95 % mohou obsahovat různé množství cílového peptidu, pokud se liší obsahem (například 80 % a 95 %).

Proto může lahvička s čistotou 99 % obsahovat méně než 10 mg peptidu, i když je na ní uvedeno 10 mg. Záleží na tom, zda údaj vyjadřuje hmotnost prášku, nebo čistý obsah peptidu. Dobrý certifikát to buď výslovně uvádí, nebo obsahuje samostatný údaj o obsahu či množství peptidu.

Obsah peptidu se stanovuje například:

  • aminokyselinovou analýzou, kdy se peptid rozloží na jednotlivé aminokyseliny a ty se změří,
  • elementární analýzou dusíku, protože protiionty ani voda dusík neobsahují,
  • kvantitativní HPLC proti referenčnímu standardu se známým obsahem.

Obsah protiiontů se měří například iontovou chromatografií. Článek v Pharmaceutical Technology doporučuje sečíst obsah peptidu, protiiontů a vody. Výsledek by se měl blížit 100 %.

Další zkoušky na certifikátu

  • Bakteriální endotoxiny. Endotoxiny jsou součástí buněčné stěny gramnegativních bakterií. Stanovují se testem LAL (lyzát amébocytů ostrorepa), postupy popisuje například americký lékopis v kapitole USP <85>. HPLC ani MS endotoxiny neodhalí, takže vysoká čistota o nich nic neříká.
  • Sterilita a mikrobiologická čistota. Týká se hlavně látek v roztoku. Návrh pokynu EMA řadí mikrobiologickou čistotu mezi typické zkoušky.
  • Vzhled. Například „bílý lyofilizovaný prášek“ nebo „čirý bezbarvý roztok“. Jednoduchá kontrola, která odhalí hrubé odchylky.
  • Rozpustnost. Údaj, v jakém rozpouštědle se látka rozpouští na čirý roztok.

Varovné signály

  • Chybí číslo šarže nebo datum výroby. Certifikát pak nejde přiřadit ke konkrétnímu balení.
  • Chybí název laboratoře nebo datum analýzy. Není jasné, kdo a kdy zkoušky provedl.
  • Všechny šarže mají stejný chromatogram nebo stejná čísla. Výsledky se vztahují ke konkrétní šarži. Bachem výslovně uvádí, že obsah peptidu je hodnota specifická pro šarži.
  • Chybí identita. Čistota bez hmotnostní spektrometrie dokládá jen to, že ve vzorku převažuje jedna látka.
  • Nereálně dokonalý výsledek, třeba čistota přesně 100,0 %. Při syntéze peptidů běžně vznikají vedlejší produkty a Evropský lékopis stanoví práh pro hlášení peptidových nečistot na 0,1 %. Výsledek bez jediného vedlejšího píku si zaslouží otázky.
  • Teoretická hmotnost nesedí. Porovnejte ji s veřejnou databází, například PubChem.
  • Nedá se nic ověřit. Žádný chromatogram, žádné spektrum, žádný kontakt na laboratoř ani ověřovací kód.

Silnějším dokladem je zkouška v nezávislé laboratoři, která s prodejcem není spojena. Některé takové laboratoře, například Janoshik Analytical v Praze, uvádějí na protokolu ověřovací klíč, s jehož pomocí lze výsledek dohledat na webu laboratoře. Tak si můžete ověřit, že dokument odpovídá záznamu laboratoře a nebyl dodatečně upraven. I u nezávislého testu ale platí vše výše uvedené: šarže, metody, identita a obsah.

Jak to funguje u Arion Peptides

Certifikáty analýzy k produktům Arion Bios zveřejňujeme na stránce Certifikáty. Ke konkrétnímu balení certifikát přiřadíte podle data výroby, které je vytištěné na obalu. Při čtení můžete postupovat podle stejného kontrolního seznamu jako u kteréhokoli jiného certifikátu.

Časté otázky

Znamená čistota 99 %, že je v lahvičce 99 % peptidu?

Ne. Čistota podle HPLC vyjadřuje podíl hledaného peptidu mezi peptidovými složkami. Hmotnost prášku zahrnuje i protiionty a vodu, které se do čistoty nepočítají. Kolik peptidu ve vzorku je, ukazuje až obsah peptidu.

Proč nestačí jen HPLC?

HPLC ukáže, kolik procent plochy píků připadá na hlavní složku, ale nepotvrdí, o jakou molekulu jde. Identitu dokládá hmotnostní spektrometrie, která porovná naměřenou hmotnost s teoretickou.

Jak poznám, že certifikát patří k mému balení?

Hledejte na certifikátu číslo šarže nebo datum výroby a porovnejte je s údajem na obalu. U produktů Arion Bios se certifikát přiřazuje podle data výroby na obalu.

Proč je podezřelá čistota 100,0 %?

Při syntéze peptidů běžně vznikají vedlejší produkty a citlivá metoda zachytí i nečistoty kolem 0,1 %. Výsledek přesně 100,0 % proto vyžaduje vysvětlení, jakou metodou a s jakou citlivostí byl získán.

Zdroje

  1. European Medicines Agency, „Guideline on the Development and Manufacture of Synthetic Peptides“ (návrh pro veřejnou konzultaci), EMA/CHMP/CVMP/QWP/387541/2023, 2023: ema.europa.eu
  2. Swietlow A, Verlander M, Gregg B, Rode H, Eggen I, Szajek A, „Control Strategies for Synthetic Therapeutic Peptide APIs – Part I: Analytical Consideration“, Pharmaceutical Technology, 2014: pharmtech.com
  3. Grosse S, Samonig M, De Pra M, Steiner F, „Impurity profiling of the synthetic peptide LL-37 using high-performance liquid chromatography with combined UV and single quadrupole mass spectrometric detection“, Thermo Fisher Scientific, aplikační poznámka 72818, 2018: thermofisher.com
  4. D'Hondt M, Bracke N, Taevernier L, Gevaert B, Verbeke F, Wynendaele E, De Spiegeleer B, „Related impurities in peptide medicines“, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2014;101:2–30. DOI: 10.1016/j.jpba.2014.06.012
  5. Erckes V, Streuli A, Chamera Rendueles L, Krämer SD, Steuer C, „Towards a Consensus for the Analysis and Exchange of TFA as a Counterion in Synthetic Peptides and Its Influence on Membrane Permeation“, Pharmaceuticals, 2025;18(8):1163. DOI: 10.3390/ph18081163
  6. Bachem, „What does net peptide content mean?“, technické FAQ: bachem.com
  7. Bachem, „Peptide Calculator“ (čistota a obsah peptidu), Knowledge Center: bachem.com
  8. U.S. Food and Drug Administration, „Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers (Edition 2)“, Guidance for Industry, 2026: fda.gov
  9. National Center for Biotechnology Information, „PubChem Compound Summary: BPC-157 (CID 9941957) a MOTS-c (CID 146675088)“: pubchem.ncbi.nlm.nih.gov, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov