Ein lyophilisiertes (gefriergetrocknetes) Peptid muss im Labor vor der weiteren Arbeit gelöst werden. Dabei ist meist von zwei Flüssigkeiten die Rede: von bakteriostatischem Wasser und von sterilem Wasser. Auf den ersten Blick unterscheiden sie sich nicht, beide sind klar und steril. Der Unterschied liegt in einem einzigen Zusatz. Dieser entscheidet jedoch darüber, wie lange eine geöffnete Durchstechflasche verwendet werden kann und für welche Versuche sich die Flüssigkeit eignet.
Was ist bakteriostatisches Wasser
Das Arzneibuch der Vereinigten Staaten (USP) definiert bakteriostatisches Wasser (Bacteriostatic Water for Injection) als steriles Wasser in Arzneibuchqualität, das einen oder mehrere geeignete antimikrobielle Stoffe enthält. Als Konservierungsmittel dient in der Regel Benzylalkohol. Die Fachinformation des Herstellers Hospira beschreibt zum Beispiel steriles, pyrogenfreies Wasser mit 0,9 % Benzylalkohol (9 mg/ml), bei einer der Packungen 1,1 %. Der pH-Wert liegt laut derselben Information bei etwa 5,7 (Bereich 4,5–7,0).
Laut offizieller Fachinformation ist bakteriostatisches Wasser ausschließlich zum Verdünnen oder Auflösen anderer Präparate bestimmt. Es ist also ein Lösungsmittel (englisch diluent) und kein eigenständiges Präparat. Das Arzneibuch weist zudem ausdrücklich darauf hin, dass die Verträglichkeit des Konservierungsmittels mit der gelösten Substanz zu berücksichtigen ist. Darauf kommen wir noch zurück.
Das Wort „bakteriostatisch“ bedeutet, dass ein Stoff das Wachstum und die Vermehrung von Bakterien hemmt. Es bedeutet nicht, dass er sie zuverlässig abtötet. Stoffe, die Bakterien abtöten, werden als bakterizid bezeichnet. Die US-Gesundheitsbehörde CDC (Centers for Disease Control and Prevention) hält zu Mehrdosenbehältnissen fest, dass das Konservierungsmittel das Bakterienwachstum begrenzen hilft, aber nicht gegen Viren wirkt und nicht vollständig vor Kontamination schützt. Bakteriostatisches Wasser ersetzt daher kein aseptisches Arbeiten.
Was ist steriles Wasser
Das Europäische Arzneibuch beschreibt in der Monographie Wasser für Injektionszwecke (0169) zwei Formen dieses Wassers. „Wasser für Injektionszwecke in Großgebinden“ dient als Trägerstoff bei der Herstellung von Arzneimitteln. Sterilisiertes Wasser (sterilisiertes Wasser für Injektionszwecke) ist zum Lösen oder Verdünnen anderer Präparate bestimmt. So fasst es auch die Leitlinie der Europäischen Arzneimittel-Agentur (EMA) zur Qualität von Wasser für pharmazeutische Zwecke zusammen. Das US-Arzneibuch kennt ein entsprechendes Präparat unter dem Namen Sterile Water for Injection.
Entscheidend ist, was steriles Wasser nicht enthält. Laut Fachinformation von Hospira enthält es kein Bakteriostatikum, keinen antimikrobiellen Stoff und keinen zugesetzten Puffer und wird nur in Einzeldosisbehältnissen geliefert. Die Anweisung des Herstellers ist eindeutig: Einzeldosisbehältnisse nicht wiederverwenden und nicht verbrauchte Reste verwerfen.
Der Grund ist einfach. Sobald eine Durchstechflasche geöffnet oder angestochen wird, können Mikroorganismen hineingelangen. Ohne Konservierungsmittel bremst nichts ihr Wachstum. Steriles Wasser ist also „reiner“ in dem Sinne, dass es außer Wasser nichts enthält. Nach dem Öffnen wird es jedoch wie ein Einmalprodukt behandelt.
Warum ein Konservierungsmittel: Mehrdosenbehältnisse
Bakteriostatisches Wasser wird in Mehrdosenbehältnissen geliefert, aus denen laut Fachinformation wiederholt entnommen werden kann. Genau deshalb enthält es ein Konservierungsmittel. Das US-Arzneibuch schreibt dafür Glasbehältnisse mit höchstens 30 ml vor.
Auch ein Konservierungsmittel bedeutet aber keine unbegrenzte Verwendbarkeit nach dem Öffnen. Im US-Gesundheitswesen und in Apotheken gilt für Mehrdosenbehältnisse die Empfehlung des Kapitels USP <797>, die auch die CDC zusammenfasst: Nach dem ersten Öffnen (zum Beispiel dem Anstechen des Stopfens) wird die Flasche mit Datum versehen und spätestens nach 28 Tagen verworfen, sofern der Hersteller für die geöffnete Flasche keine andere, kürzere oder längere Frist angibt. Einzeldosisbehältnisse enthalten laut CDC in der Regel kein Konservierungsmittel.
Wir nennen dies als Beispiel für die allgemeine Praxis bei Mehrdosenbehältnissen, nicht als Anweisung. Im Labor gelten immer die Herstellerangaben auf dem Etikett des konkreten Produkts und die internen Arbeitsanweisungen (SOP) Ihres Labors.
Wann Benzylalkohol im Labor stören kann
Benzylalkohol ist kein inerter Zusatz. In manchen Situationen kann er die gelöste Substanz oder das Versuchsergebnis beeinflussen.
Proteine und Aggregation. Konservierungsmittel in Mehrdosen-Proteinformulierungen sind dafür bekannt, dass sie die Aggregation (Verklumpung) von Proteinen fördern können. Eine Studie aus dem Jahr 2014 verglich vier gängige Konservierungsmittel am Interferon alfa-2a. Alle lösten Aggregation aus, Benzylalkohol lag in der Rangfolge auf Platz drei, nach m-Kresol und Phenol. Eine andere Arbeit untersuchte ein lyophilisiertes Protein (Interleukin-1-Rezeptorantagonist), das die Forschenden entweder in Wasser oder in einer Lösung mit 0,9 % Benzylalkohol rekonstituierten. Mit Benzylalkohol bildeten sich mehr Aggregate. Ihre Menge hing davon ab, wie gut das Protein seine Struktur während der Lyophilisation bewahrt hatte.
Diese Studien betreffen Proteine, nicht kurze Peptide, und ihre Ergebnisse lassen sich nicht ohne Weiteres übertragen. Das Verhalten jeder Substanz hängt von ihrer Sequenz ab. Man kann also nicht davon ausgehen, dass Benzylalkohol mit jeder Substanz verträglich ist.
Zellkulturen und empfindliche Assays. Benzylalkohol wirkt auf Zellmembranen. In Versuchen mit kultivierten Endothelzellen erhöhte er die Membranfluidität dosisabhängig und steigerte bei 50 mmol/l die Durchlässigkeit der Zellschicht deutlich. Zum Vergleich: 0,9 % Benzylalkohol entsprechen etwa 83 mmol/l. Nach dem Verdünnen im Kulturmedium ist die Konzentration natürlich niedriger. Bei empfindlichen zellbasierten Assays lohnt es sich dennoch, ein Lösungsmittel ohne Konservierungsmittel in Betracht zu ziehen oder zumindest eine Kontrolle nur mit dem Lösungsmittel mitzuführen.
Löslichkeit. Nicht jedes Peptid löst sich gut in Wasser, ob mit oder ohne Konservierungsmittel. Peptidhersteller wie GenScript und Bachem beschreiben in ihren Leitfäden ein allgemeines Vorgehen:
- die Löslichkeit zuerst an einer kleinen Menge der Substanz testen,
- bei kurzen Peptiden zuerst steriles Wasser versuchen,
- basische Peptide (insgesamt positive Ladung) in einer kleinen Menge verdünnter Essigsäure lösen und anschließend verdünnen,
- saure Peptide (insgesamt negative Ladung) in einer kleinen Menge verdünnten Ammoniaks lösen; bei cysteinhaltigen Peptiden rät GenScript davon ab,
- hydrophobe und neutrale Peptide in einer kleinen Menge eines organischen Lösungsmittels, typischerweise DMSO, lösen und erst dann mit Wasser oder Puffer verdünnen.
Bachem weist außerdem darauf hin, dass hohe Konzentrationen organischer Lösungsmittel mit biologischen Systemen wie Zellen nicht verträglich sind. Ein universelles Protokoll für alle Peptide gibt es laut Bachem nicht. Die Wahl des Lösungsmittels richtet sich daher nach dem Versuchsprotokoll und nach den Löslichkeitsangaben, sofern der Lieferant sie im technischen Datenblatt oder im Analysenzertifikat angibt.
Lösen eines lyophilisierten Peptids: allgemeine Grundsätze
Die folgenden Punkte beschreiben die allgemeine Laborpraxis. Mengen und Konzentrationen legt stets das Protokoll des jeweiligen Versuchs fest.
- Lassen Sie die Flasche Raumtemperatur annehmen. Peptide sind oft hygroskopisch. Bachem empfiehlt daher, das verschlossene Gefäß, idealerweise im Exsikkator, auf Umgebungstemperatur kommen zu lassen und erst dann zu öffnen. Aufgenommene Feuchtigkeit verringert den Peptidgehalt und kann die Stabilität beeinträchtigen.
- Arbeiten Sie aseptisch. Wischen Sie die Stopfen der Peptidflasche und der Lösungsmittelflasche mit einem Alkoholtupfer ab und lassen Sie sie trocknen. Verwenden Sie sterile Einmalhilfsmittel.
- Geben Sie das Lösungsmittel langsam an der Innenwand der Flasche entlang zu, nicht als direkten Strahl auf den Lyophilisatkuchen.
- Sanft schwenken, nicht schütteln. Mechanische Belastung wie kräftiges Schütteln gehört zu den beschriebenen Faktoren, die eine Proteinaggregation auslösen können. Bleibt ein Teil ungelöst, erwähnt Bachem eine Behandlung von einigen Minuten im Ultraschallbad.
- Prüfen Sie das Aussehen. Die Lösung sollte klar sein, ohne Trübung und ohne sichtbare Partikel. Eine Trübung kann auf unvollständige Lösung oder Aggregation hindeuten. In diesem Fall ist es besser, zu den Löslichkeitsangaben des Lieferanten zurückzukehren, als weiterzumachen.
- Beschriften Sie die Flasche mit dem Namen der Substanz, dem verwendeten Lösungsmittel und dem Herstellungsdatum.
Lagerung von geöffnetem bakteriostatischem Wasser und fertigen Lösungen
Bakteriostatisches Wasser. Die Fachinformation von Hospira nennt eine Lagerung bei 20–25 °C. Das bakteriostatische Wasser aus unserem Sortiment wird bei Raumtemperatur und lichtgeschützt gelagert. Es gelten stets die Angaben auf dem Etikett des jeweiligen Produkts. Nach dem ersten Öffnen empfiehlt es sich, das Datum auf der Flasche zu notieren.
Die Fachinformation schreibt ausdrücklich vor, bei einmaligem wie wiederholtem Anstechen und Entnehmen aseptisch zu arbeiten. In der Praxis bedeutet das: vor jeder Entnahme den Stopfen mit einem Alkoholtupfer abwischen und trocknen lassen, ein neues steriles Hilfsmittel verwenden und nichts in die Flasche zurückgeben. Trüber Inhalt oder Inhalt mit sichtbaren Partikeln wird nach allgemeiner Regel nicht verwendet.
Fertige Peptidlösungen. Bachem empfiehlt, Peptide nicht langfristig in Lösung aufzubewahren, auch nicht in steriler Lösung. Wenn es sich nicht vermeiden lässt, rät Bachem, die Lösung in kleinere Portionen (Aliquots) aufzuteilen. Eine kürzere Haltbarkeit haben laut Bachem Peptide, die Asparagin, Glutamin, Methionin, Cystein oder Tryptophan enthalten. Die konkreten Lagerbedingungen legt stets der Lieferant der jeweiligen Substanz fest. Für Produkte von Arion Bios gelten die Angaben beim Produkt: bei 2–8 °C lagern, vor Licht schützen, nicht einfrieren und in der original verschlossenen Verpackung aufbewahren.
Vergleich: bakteriostatisches vs. steriles Wasser
| Eigenschaft | Bakteriostatisches Wasser | Steriles Wasser |
|---|---|---|
| Zusammensetzung | Steriles Wasser in Arzneibuchqualität mit Konservierungsmittel, typischerweise 0,9 % Benzylalkohol | Steriles Wasser in Arzneibuchqualität ohne Zusätze |
| Konservierungsmittel | Ja – hemmt das Bakterienwachstum, tötet Bakterien nicht zuverlässig ab, wirkt nicht gegen Viren | Nein |
| Behältnis | Mehrdosenbehältnis, wiederholte Entnahme möglich | Einzeldosisbehältnis |
| Nach dem Öffnen | Wiederholte Entnahme unter aseptischen Bedingungen; die Frist legt der Hersteller fest (allgemeine Praxis bei Mehrdosenbehältnissen: 28 Tage, sofern der Hersteller nichts anderes angibt) | Nicht verbrauchte Reste werden verworfen |
| Typischer Einsatz im Labor | Lösen von Substanzen, die mit Benzylalkohol verträglich sind, wenn aus einer Lösungsmittelflasche wiederholt entnommen wird | Versuche, bei denen ein Konservierungsmittel stören würde (empfindliche Zellkulturen und Assays, aggregationsanfällige Substanzen), und einmalige Herstellung einer Lösung |
| Einschränkungen | Benzylalkohol kann die Aggregation von Proteinen fördern, wirkt auf Zellmembranen und kann manche Assays beeinflussen | Nach dem Öffnen kein Schutz vor mikrobiellem Wachstum |
Bakteriostatisches Wasser bei Arion Peptides
Wir bieten bakteriostatisches Wasser als Laborzubehör zu lyophilisierten Forschungspeptiden an: bakteriostatisches Wasser. Wie alle unsere Produkte ist es ausschließlich für Labor- und Forschungszwecke bestimmt. Analysenzertifikate zu den Peptidchargen von Arion Bios finden Sie auf der Seite Analysenzertifikate.
Häufige Fragen
Ist bakteriostatisches Wasser dasselbe wie steriles Wasser?
Nein. Die Grundlage ist dieselbe: steriles Wasser in Arzneibuchqualität. Bakteriostatisches Wasser enthält zusätzlich ein Konservierungsmittel, meist 0,9 % Benzylalkohol, und wird im Mehrdosenbehältnis geliefert. Steriles Wasser enthält keine Zusätze und ist nach dem Öffnen für den einmaligen Gebrauch bestimmt.
Tötet bakteriostatisches Wasser Bakterien ab?
Nicht zuverlässig. Das Konservierungsmittel hemmt Wachstum und Vermehrung von Bakterien, ist aber kein Desinfektionsmittel. Laut CDC wirkt es nicht gegen Viren und schützt nicht vollständig vor Kontamination. Aseptisches Arbeiten ist daher auch hier notwendig.
Wie lange kann eine geöffnete Flasche bakteriostatisches Wasser verwendet werden?
Maßgeblich sind die Herstellerangaben auf dem Etikett. Im Gesundheitswesen gilt für Mehrdosenbehältnisse nach USP <797> allgemein eine Frist von 28 Tagen ab dem ersten Öffnen, sofern der Hersteller nichts anderes angibt. Steriles Wasser ohne Konservierungsmittel ist ein Einzeldosisbehältnis, Reste werden nach dem Öffnen verworfen.
Wann ist steriles Wasser oder ein anderes Lösungsmittel die bessere Wahl?
Dort, wo Benzylalkohol das Ergebnis beeinflussen könnte, etwa bei empfindlichen Zellkulturen und Assays oder bei aggregationsanfälligen Substanzen. Auch die Löslichkeit der Substanz selbst kann ein anderes Lösungsmittel erfordern, zum Beispiel verdünnte Essigsäure bei basischen Peptiden oder DMSO bei hydrophoben. Entscheidend sind das Versuchsprotokoll und die Angaben des Lieferanten.
Quellen
- Hospira, Inc. (Pfizer), „Bacteriostatic Water for Injection, USP“, Fachinformation (Prescribing Information): labeling.pfizer.com
- Hospira, Inc. (Pfizer), „Sterile Water for Injection, USP“, Fachinformation (Prescribing Information): labeling.pfizer.com
- United States Pharmacopeia, „Bacteriostatic Water for Injection“, Monographie, USP 38–NF 33, 2015: drugfuture.com
- European Medicines Agency, „Guideline on the quality of water for pharmaceutical use“, EMA/CHMP/CVMP/QWP/496873/2018, 2020 (mit Verweis auf die Ph.-Eur.-Monographie 0169 Wasser für Injektionszwecke): ema.europa.eu
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC), „Preventing Unsafe Injection Practices“, Zusammenfassung der Empfehlungen von USP <797> für Mehrdosen- und Einzeldosisbehältnisse: cdc.gov
- Bis RL, Mallela KMG, „Antimicrobial preservatives induce aggregation of interferon alpha-2a: the order in which preservatives induce protein aggregation is independent of the protein“, International Journal of Pharmaceutics, 2014;472:356–361. DOI: 10.1016/j.ijpharm.2014.06.044
- Roy S, Jung R, Kerwin BA, Randolph TW, Carpenter JF, „Effects of benzyl alcohol on aggregation of recombinant human interleukin-1-receptor antagonist in reconstituted lyophilized formulations“, Journal of Pharmaceutical Sciences, 2005;94(2):382–396. DOI: 10.1002/jps.20258
- Mahler HC, Friess W, Grauschopf U, Kiese S, „Protein aggregation: pathways, induction factors and analysis“, Journal of Pharmaceutical Sciences, 2009;98(9):2909–2934. DOI: 10.1002/jps.21566
- Alvarado A, Butterfield DA, Hennig B, „Disruption of endothelial barrier function: relationship to fluidity of membrane extracellular lamella“, International Journal of Biochemistry, 1994;26(4):575–581. DOI: 10.1016/0020-711x(94)90016-7
- GenScript, „Peptide Solubility Guidelines“, technischer Leitfaden: genscript.com
- Bachem, „Handling and Storage Guidelines for Peptides“, Knowledge Center: bachem.com